[發明專利]一種可食用刺葡萄愈傷組織細胞花色苷提取純化的方法

有效

• 申請號: 202110677464.6
• 申請日: 2021-06-18
• 公開（公告）號: CN113461649B
• 公開（公告）日: 2023-09-22
• 發明（設計）人: 賴呈純;張靜;賴恭梯;潘紅;黃賢貴;高慧穎;王琦
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院農業工程技術研究所
• 主分類號: C07D311/62
• 分類號: C07D311/62;C12N5/04
• 代理公司: 福州市京華專利代理事務所(普通合伙) 35212
• 代理人: 林云嬌

1.一種可食用刺葡萄愈傷組織細胞花色苷提取純化的方法，其特征在于：包含以下步驟：

(1)刺葡萄愈傷組織細胞的獲取：利用植物組織培養技術，將紫紅色刺葡萄愈傷組織細胞培養在固體培養集中培養30～35d，即可獲得充分成熟的、富含花色苷的刺葡萄愈傷組織細胞；所述固體培養基為添加了1.0mg/mL2,4-D、30g/L糖、6g/L瓊脂粉的MS固體培養基；

(2)刺葡萄愈傷組織細胞的預處理：將步驟(1)獲得的刺葡萄愈傷組織細胞從培養瓶中取出，去除培養基，收集刺葡萄愈傷組織細胞，用冷凍干燥法或低溫真空干燥法進行干燥，獲得刺葡萄愈傷組織細胞干品；短時間保存可以置于4℃冰箱中冷藏，長期保存可置于-40℃或-80℃冰箱中凍存；

(3)制備花色苷提取液：取步驟(2)獲得的刺葡萄愈傷組織細胞干品，放入破壁勻漿機中，按提取液體體積與刺葡萄愈傷組織細胞干品重量的提取劑料比為18ml:1g的劑量，加入冷凍酸化70％～75％食品級乙醇，勻漿；勻漿后的提取混合液置于超聲儀器中，于35℃～45℃、功率300W～400W、提取時間50min～60min，提取刺葡萄愈傷組織細胞中花色苷；超聲結束后，于4℃、轉速5000rpm～7000rpm，離心10min～15min，取上清；沉淀按上述操作再次加入適當減量的提取劑提取花色苷，重復2次；最后合并上清液，即得刺葡萄愈傷組織細胞花色苷提取液；

(4)花色苷提取液過濾：將步驟(3)獲得的刺葡萄愈傷組織細胞花色苷提取液，通過0.22μm有機濾膜，進行真空抽濾，抽濾后，獲得純凈的刺葡萄愈傷組織細胞花色苷提取液；

(5)花色苷提取液濃縮：將步驟(4)獲得的純凈刺葡萄愈傷組織細胞花色苷提取液轉入旋轉蒸發瓶中，于35℃～45℃水浴中，避光，進行真空蒸發濃縮，將乙醇與花色苷提取液分離，得到刺葡萄愈傷組織細胞花色苷濃縮液；

(6)花色苷濃縮液檢測：檢測花色苷濃縮液的質量濃度；

(7)花色苷純化和洗脫：根據步驟(6)檢測的花色苷濃縮液質量濃度，用酸化純凈水將花色苷濃縮液的濃度稀釋至0.8～1.0mg/mL，將稀釋后的花色苷稀釋液通過預處理的弱極性或非極性高分子多孔微球的吸附與洗脫，獲得純化后的含有刺葡萄愈傷組織細胞花色苷的洗脫液；

所述酸化純凈水配制過程如下：取純凈水，用適量的檸檬酸調整純凈水的酸堿度，使純凈水的pH為2.0～3.0；

所述預處理的弱極性或非極性高分子多孔微球的方法如下：將弱極性或非極性高分子多孔微球置于無水乙醇中浸泡24～36h，充分溶脹后濕法裝柱，用純凈水沖洗，洗至無醇味；接著用0.05～0.1mol/L鹽酸洗至流出液呈酸性后浸泡2～4h，再用超純水洗至中性；最后用1.0～1.5mol/L氫氧化鈉溶液洗至流出液呈堿性后浸泡2～4h，最后用純凈水洗至中性；

所述吸附與洗脫步驟如下：將刺葡萄愈傷組織花色苷提取液的稀釋液，采用恒流泵泵入處理填充好的弱極性或非極性高分子多孔微球中，流速設置為每分鐘3～4mL；待稀釋液吸附至柱體30％～40％處停止泵入，靜置30～40min，使其充分吸附后，用酸化純凈水沖洗3～4個柱體積，充分去除糖等雜質，再用含3％～5％檸檬酸的75％～80％酸化食品級乙醇解吸附，解吸流速設為每分鐘5～6mL；當流出液帶有紅色時，開始收集洗脫液直至顏色消失；

(8)純化花色苷獲取：將步驟(7)獲得的純化花色苷洗脫液，轉入旋轉蒸發瓶中，于35℃～45℃水浴中，避光，進行真空蒸發濃縮，至不能再蒸發出乙醇為止；獲得的蒸發濃縮液預冷凍后，轉入冷凍干燥機中，于-45℃～50℃下，真空度15Pa～25Pa，冷凍干燥48～60h，獲得純化花色苷。

2.根據權利要求1所述的一種可食用刺葡萄愈傷組織細胞花色苷提取純化的方法，其特征在于：所述步驟(2)中，所述刺葡萄愈傷組織細胞冷凍干燥具體步驟如下：將收集的刺葡萄愈傷組織細胞，用液氮迅速冷凍5～6min后，轉入冷凍干燥機內，于-45℃-50℃、真空度15Pa～25Pa，冷凍干燥72～80h，取出后，獲得刺葡萄愈傷組織細胞干品。

3.根據權利要求1所述的一種可食用刺葡萄愈傷組織細胞花色苷提取純化的方法，其特征在于：所述步驟(2)中，所述刺葡萄愈傷組織細胞低溫真空干燥具體步驟如下：收集刺葡萄愈傷組織細胞，采用低溫真空干燥機進行干燥，溫度設置為35℃、真空度20～35Pa，將刺葡萄愈傷組織細胞干燥至恒重，獲得刺葡萄愈傷組織細胞干品。