[發明專利]用于檢測獼猴桃軟腐病病原菌葡萄座腔菌的引物組及應用

在審

• 申請號: 202110677294.1
• 申請日: 2021-06-18
• 公開（公告）號: CN113430292A
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發明（設計）人: 苗敏;李歡歡;劉永勝;劉奎;劉洪林
• 申請（專利權）人: 合肥工業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 重慶市信立達專利代理事務所(普通合伙) 50230
• 代理人: 劉潔

本發明涉及植物檢疫技術領域，公開了用于檢測獼猴桃軟腐病病原菌葡萄座腔菌的引物組，包括引物組一和引物組二中的任意一組或兩組，所述引物組一包括正向引物B.d?17和反向引物B.d?393，所述引物組二包括正向引物B.d?84和反向引物B.d?472；還公開了應用。本發明可快速檢測獼猴桃中的葡萄座腔菌Botryosphaeriadothidea，檢測準確度高，特異性高。

技術領域

本發明涉及植物檢疫技術領域，具體涉及用于檢測獼猴桃軟腐病病原菌葡萄座腔菌的引物組及應用。

背景技術

獼猴桃原產于我國，因其果實營養豐富，富含維生素C和多種礦質元素及氨基酸等而廣受人們喜愛。獼猴桃產業發展迅速，其栽培面積由1978年的零起步，到2017年達到250,000公頃，超過世界其他所有獼猴桃生產國種植面積總和。獼猴桃屬于呼吸躍變型果實，有明顯的生理后熟過程，采后極易變軟腐爛，不耐貯藏。獼猴桃軟腐病是發生在果實貯藏期的一種最為常見的真菌性病害，分布廣，發病快，發病率高，易造成嚴重的經濟損失，且有逐年加重的趨勢，對獼猴桃產業發展產生了嚴重威脅。目前報道的獼猴桃軟腐病病原菌有葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea、擬莖點霉菌Phomopsis spp.(有性態Diaporthe spp.)、灰霉菌Botrytis cinerea、鏈格孢菌Alternaria spp.、青霉菌Penicillium spp.等，其中葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea和擬莖點霉菌Phomopsis spp.(有性態Diaporthespp.)為主要致病菌。

目前，獼猴桃軟腐病病原菌的檢測鑒定主要依賴于傳統的病原菌分離鑒定，主要包括癥狀觀察、病原菌分離、顯微形態觀察及分子鑒定等，耗時較長，極不利于獼猴桃軟腐病的早期檢測及預防。PCR檢測是最常用的一種分子生物學檢測方法，可通過快速擴增病原微生物的特異性核酸序列，實現病原菌的快速檢測，近年來已在傳染病、食源性致病菌污染、環境污染、腫瘤遺傳標記等領域廣泛應用，是比較成熟且應用范圍最廣的檢測技術。因此，研究開發適于獼猴桃軟腐病病原菌的快速檢測特異性引物及方法，對于獼猴桃軟腐病的早期檢測，預防和控制具有非常重要的意義和經濟意義。

發明內容

基于以上問題，本發明提供用于檢測獼猴桃軟腐病病原菌葡萄座腔菌的引物組及應用，本發明可快速檢測獼猴桃中的葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea，檢測準確度高，特異性高。

為解決以上技術問題，本發明提供了用于檢測獼猴桃軟腐病病原菌葡萄座腔菌的引物組，包括引物組一和引物組二中的任意一組或兩組，所述引物組一包括正向引物B.d-17和反向引物B.d-393，所述B.d-17和B.d-393的核苷酸序列分別見SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2；所述引物組二包括正向引物B.d-84和反向引物B.d-472，所述B.d-84和B.d-472的核苷酸序列分別見SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。

進一步的，所述引物組用于PCR擴增時的擴增反應體系如下：采用25μLPCR反應體系，具體如下：10×Taq PCR buffer 2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，Taq酶0.5μL，上下游引物各0.5μL，模板DNA 1μL，無菌ddH₂O 18μL；

所述引物組用于PCR擴增時的擴增程序如下：94℃預變性3min，94℃變性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環，72℃總延伸5min。

為解決以上技術問題，本發明還提供了引物組在制備用于檢測獼猴桃軟腐病病原菌Botryosphaeria dothidea的試劑盒中的應用。

與現有技術相比，本發明的有益效果是：本發明可快速檢測獼猴桃中的葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea，檢測準確度高，特異性高。

附圖說明

圖1為本發明的實施例的引物組特異性的PCR檢測結果圖；