[發明專利]一種高產花青素刺葡萄懸浮細胞系建立的方法

有效

• 申請號: 202110677142.1
• 申請日: 2021-06-18
• 公開（公告）號: CN113667628B
• 公開（公告）日: 2023-04-25
• 發明（設計）人: 賴呈純;潘紅;賴恭梯;張靜;黃賢貴;高慧穎;王琦
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院農業工程技術研究所
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12P17/06
• 代理公司: 福州市京華專利代理事務所(普通合伙) 35212
• 代理人: 林云嬌

1.一種高產花青素刺葡萄懸浮細胞系建立的方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)材料與預處理：以長期繼代保持的紫紅色刺葡萄愈傷組織細胞系為材料，挑選紫紅色均勻的、生長狀態一致的刺葡萄愈傷組織，于同一種固體培養基中進行對數細胞同步增殖培養3代，使刺葡萄愈傷組織生長狀態達到同步化，愈傷組織團松散、紫紅色均勻、絕大部分細胞呈圓形；

(2)懸浮培養促發：將在固體培養基上進行對數細胞同步增殖培養的第4代刺葡萄愈傷組織培養至18天，于超凈工作臺中，取新鮮、松散易碎的紅色愈傷組織，放入裝有液體培養基的三角瓶中，用鑷子輕輕夾散愈傷組織團，于25℃，光照強度2000～3000Lux，光照時間12h/天的條件下，搖床轉速120rpm，振蕩培養；

(3)細胞懸浮培養的建立：取經懸浮促發獲得的分散性較好的刺葡萄懸浮細胞，按懸浮細胞液體積：新鮮的液體培養基體積＝1:8的比例，接種到新的液體培養基中培養10天后，進行繼代培養，獲得刺葡萄細胞懸浮液種子細胞；

(4)懸浮細胞繼代增殖：將獲得的刺葡萄細胞懸浮液種子細胞，每隔10天按步驟(3)操作方式繼代增殖；

(5)懸浮細胞延時培養與花青素生產：將增殖培養后的刺葡萄懸浮細胞進行延時培養，即將增殖后的細胞繼續培養至20天，達到懸浮細胞生長的穩定期，此時細胞中花青素含量也達到穩定期；

(6)懸浮細胞系長期保持：采用對數中期細胞隔代交替繼代培養，按步驟(3)操作方式，選擇對數生長期中期即培養10天的刺葡萄懸浮細胞進行繼代，并在1號液體培養基和2號液體培養基中采取隔代交替繼代培養，即可長期繼代保持刺葡萄懸浮細胞系；

所述液體培養基為MS基本培養基附加1.0mg/L?2,4-D、30g/L蔗糖的培養基，pH調整至6.0；

所述1號液體培養基為MS基本培養基附加1.0mg/L?2,4-D、30g/L蔗糖的培養基，pH調整至6.0；所述2號液體培養基為MS基本培養基附加1.0mg/L?2,4-D、100mg/L肌醇、30g/L蔗糖的培養基，pH調整至6.0。

2.根據權利要求1所述的一種高產花青素刺葡萄懸浮細胞系建立的方法，其特征在于：當步驟(2)進行促發培養時，需間隔快速振搖，即接種后的刺葡萄細胞懸浮液，每隔6～8個小時，將培養瓶從搖床取出，用手快速搖動，將沾粘在瓶壁上的細胞洗滌入液體培養基，每天重復該操作3～4次，如此反復，直至10d后懸浮促發的完成。

3.根據權利要求1所述的一種高產花青素刺葡萄懸浮細胞系建立的方法，其特征在于：所述步驟(3)的具體操作如下：從搖床中取出培養瓶至超凈工作臺中，用手快速搖勻，利用滅菌的移液器移取種子細胞懸浮液，轉入其8倍體積的新鮮的液體培養基中進行培養，期間確保較大的細胞團不被轉移；懸浮細胞經4天培養進入對數生長期，培養至10天進入對數生長期中期，此時懸浮細胞分散、細胞小且呈圓形、細胞質濃密、細胞生長旺盛，即為刺葡萄細胞懸浮液種子細胞；如此重復培養4～5代，即可獲得細胞高度分散、生長狀態一致、紫紅色均勻的刺葡萄懸浮培養細胞。

4.根據權利要求1所述的一種高產花青素刺葡萄懸浮細胞系建立的方法，其特征在于：所述步驟(6)中對數細胞隔代交替繼代培養方式如下：將處于對數生長期中期的刺葡萄懸浮細胞，按懸浮細胞液體積：新鮮的液體培養基體積＝1:8的比例，接種到1號液體培養基中繼代培養2～3代，然后轉入2號液體培養基中繼代培養1代，如此反復，即可長期繼代保持刺葡萄懸浮細胞系。

5.根據權利要求1-4任一項所述的一種高產花青素刺葡萄懸浮細胞系建立的方法，其特征在于：所述固體培養基為MS基本培養基附加1.0mg/L2,4-D、30g/L蔗糖、6.0g/L瓊脂粉的培養基，pH調整至6.0。