[發明專利]一種用于檢測細胞類泛素修飾蛋白的新型細胞裂解緩沖液

在審

• 申請號: 202110676904.6
• 申請日: 2021-06-18
• 公開（公告）號: CN113484524A
• 公開（公告）日: 2021-10-08
• 發明（設計）人: 黃超;李勇;譚時銳;趙敏
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/53;C12N1/06
• 代理公司: 北京眾允專利代理有限公司 11803
• 代理人: 沈小青

本發明公開了一種用于檢測細胞類泛素修飾蛋白的新型細胞裂解緩沖液，在人和動物細胞內存在大量小分子修飾的蛋白，尤其是受到類泛素分子修飾的蛋白，為提高其檢測效率，通過優化調整動物細胞裂解緩沖液各成分組成比例，并創新性的加入相關試劑成分，以及改變完善細胞裂解流程，能高度有效裂解各種動物原生代細胞和傳代培養細胞，并為后期實驗，包括蛋白鑒定，蛋白純化，抗體制備等實驗，提供良好的實驗用前期蛋白樣品。

技術領域

本發明屬于細胞檢測技術領域，具體涉及一種用于檢測細胞類泛素修飾蛋白的新型細胞裂解緩沖液。

背景技術

細胞內存在多種類泛素小蛋白分子，包括Ubiquitin,SUMO,ISG 等，它們在細胞內通過級聯反應，共價連接到底物蛋白分子上，從而調控底物蛋白的分子功能。因此，準確高效的鑒定受到類泛素分子修飾的蛋白底物在生物醫學基礎科研和臨床實踐中有重要意義。

常用于鑒定細胞內受到類泛素分子修飾的蛋白的技術方法主要有免疫印跡，免疫共沉淀，蛋白純化。然而，所有這些實驗技術的實施，均建立在獲得適合的細胞蛋白樣品的基礎之上。到目前為止，廣泛用于細胞蛋白樣品制備的細胞裂解緩沖液均可高效裂解細胞。然而，由于細胞內受到類泛素分子修飾的蛋白僅占到該蛋白總量的0.1～5％，甚至更低，并且通常處于動態的修飾和去修飾平衡當中；同時，由于細胞內存在大量的去類泛素修飾酶類，這些酶類在細胞裂解的同時可導致已發生類泛素修飾的蛋白去類泛素化，從而導致應用這些細胞裂解緩沖液獲得的細胞蛋白樣品大多數情況下只能檢測到未被類泛素修飾的蛋白，而不能檢測到受到類泛素分子修飾的蛋白。

因此，如何通過優化創新細胞裂解緩沖液的組成成分，使之既能高效裂解細胞，又能有效的在后續實驗中檢測到極低含量的受到類泛素分子修飾的底物蛋白，就成為一個迫切需要解決的現實問題。

發明內容

為了解決上述提到的技術問題，本發明設計了一種用于檢測細胞類泛素修飾蛋白的新型細胞裂解緩沖液，通過以下方法實現：

一種用于檢測細胞類泛素修飾蛋白的新型細胞裂解緩沖液，其特征在于，包括：Tris–HCl(三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽)、NaCl、Sodium dodecyl sulfate(SDS，十二烷基硫酸鈉)、EDTA(乙二胺四乙酸)、Nonidet P-40(乙基苯基聚乙二醇)、Sodium deoxycholate(脫氧膽酸鈉)、Dithiothreitol(DTT,二硫蘇糖醇)、MG-132(蛋白酶體抑制劑)中的幾種，由上述的幾種搭配組成緩沖液；

優選的，所述緩沖液由48-52mM Tris–HCl、148-152mM NaCl、 0.5-1.5％Sodiumdodecyl sulfate、4-6mM EDTA組成；

優選的，所述Tris–HCl 50mM、NaCl 150mM、1％Sodium dodecyl sulfate、5mMEDTA組成緩沖液1；Tris–HCl的PH為7.4；

優選的，所述緩沖液由48-52mM Tris–HCl、148-152mM NaCl、 4-6mM EDTA、1.5-2.5％Nonidet P-40、0.5-1％Sodium deoxycholate、 8-12mM Dithiothreitol、8-12uMMG-132、95-105ug/ml Protease inhibitor；

優選的，所述Tris–HCl 50mM、NaCl 150mM、EDTA 5mM、2％ Nonidet P-40、0.5％Sodium deoxycholate、10mM Dithiothreitol、 10uM MG-132、100ug/ml Proteaseinhibitor組成緩沖液2；Tris –HCl的PH為7.8；

一種用于檢測細胞類泛素修飾蛋白的新型細胞裂解緩沖液對細胞裂解的方法為：