[發明專利]一種非洲豬瘟病毒抗體的血清學檢測方法

有效

• 申請號: 202110676027.2
• 申請日: 2021-06-18
• 公開（公告）號: CN113406065B
• 公開（公告）日: 2022-03-25
• 發明（設計）人: 步志高;劉文興;陳偉業;劉任強
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所（中國動物衛生與流行病學中心哈爾濱分中心）
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78;G01N1/38
• 代理公司: 北京象合知識產權代理事務所(普通合伙) 11893
• 代理人: 封明艷;鄭慧娟

本發明涉及一種非洲豬瘟血清抗體IPMA檢測試劑及其制備方法，所述檢測試劑中非洲豬瘟病毒選擇非洲豬瘟減毒株(HLJ/18?7GD)，感染細胞選擇PK15細胞作為非洲豬瘟減毒株(HLJ/18?7GD)的接種細胞。檢測用抗原是感染細胞的全病毒，檢測出的抗體能夠較真實地體現抗體本身或接近抗體本身的血清反應，在非洲豬瘟缺乏針對所有毒株有效中和抗體的條件下，IPMA具備成為ASF血清學檢測“金標準”的潛在價值。本發明的IPMA檢測試劑在檢測的敏感性上高于ELISA，特異性和檢測時間上與ELISA檢測相當，但對儀器設備要求較低，只需借助普通光學顯微鏡進行觀察和判定，同時，IPMA檢測結果可長期保存，便于后期實驗結果整理與檔案調取。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及病毒檢測技術領域。

背景技術

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fevervirus, ASFV)引起豬的一種急性、烈性和高度傳染性疾病，目前尚未有商品化預防用疫苗和有效的治療性藥物。非洲豬瘟病毒屬于非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬，是該屬目前的唯一成員。ASFV主要感染家豬、野豬，臨床癥狀與經典豬瘟(Classical swine fever,CSF)相似，以持續性發熱為主，豬只表現為食欲減退或消失，呼吸困難。豬只感染ASFV后通常會急性死亡，死亡率高達100％。2016年至2020年，全球共發生14327起ASF疫情，損失820萬頭豬。據不完全統計，自2018年疫情在我國爆發以來，國內報道的ASF疫情已達188起，撲殺生豬超過120萬頭，給我國養豬業造成了嚴重的損失。如今ASF嚴重威脅到了我國乃至世界的豬肉生產和糧食安全，是世界動物衛生組織(Office International Des Epizooties,OIE)高度關注與持續監控的傳染病，中國將其列為一類動物疫病。

ASFV是目前唯一發現的通過節肢動物作為媒介傳播的一種雙鏈核質大DNA病毒(nucleocytoplasmic large DNA viruses,NCLDV)。其病毒粒子呈正20面體的多層結構，由內到外分別是核仁、蛋白質核殼、脂質包膜以及最外層的蛋白質衣殼。通過冷凍電子顯微鏡對ASFV進行結構分析，表明ASFV粒子直徑在260-300納米之間，其蛋白質外殼由主要衣殼蛋白(p72)和四種次要衣殼蛋白(M1249,P17,P49和H240R)構成。ASFV基因組長度約為170-190Kbp，可以編碼151-167個開放閱讀框(Opening Reading Frames，ORF)。

常用的非洲豬瘟病毒的檢測方法有酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、血清中和試驗、免疫熒光技術、聚合酶鏈式反應(PCR)、核酸探針和基因芯片等。這些方法具有很好的特異性、靈敏性和高效性，但其費用相對高，設備要求也較高，不利于基層和臨床推廣。

血清學方法是流行病學監測的重要內容和防控策略制定的重要依據，特別是對ASF耐過豬、ASF弱毒株感染豬(臨床癥狀輕微，不易被發現)的檢測具有重要意義，同時一旦商品化的ASF疫苗投入市場，還會成為免疫監測的強有力手段。同時免疫過氧化物酶單層細胞試驗(immunoperoxidasemonolayerassay，IPMA)具有快速、敏感、特異的特點。在光學顯微鏡下即可觀察并判定結果。另外，IPMA反應板可提前制備，4℃長期保存；IPMA的反應結果可長期保存，便于觀察和分析。

我國生豬飼養大致分為散養和規模化養殖兩種類型，它們在飼養管理、實驗室檢測能力和防疫水平上存在差異。對于散養的農戶和飼養管理水平較低的中小企業來講，疫病防控體系往往不健全，檢測設備也相對落后或匱乏，因此在非洲豬瘟疫病傳播期間，IPMA檢測方法是一種不錯的選擇。

但是IPMA檢測對于抗原的安全性要求，是我國非洲豬瘟病毒流行分離株(PIG/HLJ/18) 所不能滿足的，其次針對ASF耐過豬、ASF弱毒株感染豬，抗體反應不明顯，這時會影響IPMA 的檢出率。國外ASF-IPT(ASF-IPMA)檢測方法中采用的病毒是ASF細胞適應株，采用的細胞為MS或Vero細胞，適應后的毒株突變較多，可能存在未知的抗原性變化。