[發(fā)明專利]一種基于環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)的底棲動(dòng)物完整性評(píng)價(jià)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110675789.0
• 申請(qǐng)日: 2021-06-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113403400A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-09-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張效偉;張麗娟;楊江華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/686;G06Q10/06;G06Q50/26
• 代理公司: 江蘇瑞途律師事務(wù)所 32346
• 代理人: 王琳琳;陳彬

1.一種基于eDNA宏條形碼技術(shù)的底棲動(dòng)物生物完整性評(píng)價(jià)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)參考點(diǎn)和受損點(diǎn)的確定；

(2)采集參考點(diǎn)和受損點(diǎn)樣品并提取環(huán)境DNA；

(3)以提取的環(huán)境DNA為模板，擴(kuò)增條形碼片段、測(cè)序并基于樣本對(duì)應(yīng)的操作分類單元信息進(jìn)行物種注釋；

(4)根據(jù)步驟(3)結(jié)果計(jì)算定義的多種生物完整性指數(shù)候選指標(biāo)；

(5)根據(jù)步驟(4)的計(jì)算結(jié)果篩選最終的生物完整性指數(shù)指標(biāo)；

(6)根據(jù)步驟(5)中確定的最終指標(biāo)計(jì)算底棲動(dòng)物生物完整性得分；

(7)根據(jù)底棲動(dòng)物生物完整性得分劃分底棲動(dòng)物健康等級(jí)。

2.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于eDNA宏條形碼監(jiān)測(cè)的底棲動(dòng)物生物完整性評(píng)價(jià)方法，其特征在于：步驟(1)中所述參考點(diǎn)的確定條件為：

a)湖庫(kù)參考點(diǎn)：(i)總氮、總磷等營(yíng)養(yǎng)鹽指標(biāo)達(dá)到地表水Ⅳ類水標(biāo)準(zhǔn)；(ii)綜合營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)小于監(jiān)測(cè)樣本的25％分位數(shù)；(iii)有沉水植被分布；(iv)樣點(diǎn)水域無(wú)航道、養(yǎng)殖和娛樂(lè)等功能，受水利工程影響??；

和/或b)河流參考點(diǎn)：(i)總磷≤0.3mg/L，氨氮≤2.0mg/L；(ii)監(jiān)測(cè)斷面上游來(lái)水方向有湖、蕩等前置緩沖區(qū)或沿岸有水生植物分布。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種基于eDNA宏條形碼監(jiān)測(cè)的底棲動(dòng)物生物完整性評(píng)價(jià)方法，其特征在于：所述步驟(2)樣品采集包括：采集水體底部沉積物，冷凍保存；環(huán)境DNA提取包括解凍，乙醇浸提，離心，DNA提取。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種基于eDNA宏條形碼監(jiān)測(cè)的底棲動(dòng)物生物完整性評(píng)價(jià)方法，其特征在于：所述步驟(3)中，擴(kuò)增環(huán)境DNA的引物對(duì)包括上游引物mlCOIintF：GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC和下游引物為dgHCO2198：TAAACYTCAGGRTGACCRAARAAYCA；所述測(cè)序包括對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序；所述物種注釋包括通過(guò)qiime、usearch等軟件平臺(tái)分析獲得每個(gè)樣本對(duì)應(yīng)的操作分類單元信息，并采用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU進(jìn)行物種注釋。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種基于eDNA宏條形碼監(jiān)測(cè)的底棲動(dòng)物生物完整性評(píng)價(jià)方法，其特征在于：所述步驟(4)中定義的生物完整性指數(shù)候選指標(biāo)需要包括評(píng)價(jià)群落豐富度、物種優(yōu)勢(shì)度、物種組成、物種耐污值、遺傳多樣性的指標(biāo)。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種基于eDNA宏條形碼監(jiān)測(cè)的底棲動(dòng)物生物完整性評(píng)價(jià)方法，其特征在于：所述定義的生物完整性指數(shù)候選指標(biāo)不少于27種。

7.根據(jù)權(quán)利要求3-6任一所述的基于eDNA宏條形碼監(jiān)測(cè)的底棲動(dòng)物生物完整性評(píng)價(jià)方法，其特征在于：所述定義的生物完整性指數(shù)候選指標(biāo)及計(jì)算公式包括如下：

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種基于eDNA宏條形碼監(jiān)測(cè)的底棲動(dòng)物生物完整性評(píng)價(jià)方法，其特征在于：所述步驟(5)中篩選最終的生物完整性指數(shù)指標(biāo)包括：

a)分布范圍篩選：計(jì)算每個(gè)指數(shù)分布的最小值，Q25，中位數(shù)，Q75，最大值及值0的點(diǎn)位占比，保留在80％以上點(diǎn)位的值0且最大值Q75中位數(shù)Q25最小值的指數(shù)，舍棄值域區(qū)間相對(duì)狹窄的指標(biāo)；

b)箱體判別分析：采用箱線圖法分析進(jìn)入判別能力分析的各參數(shù)在參照狀態(tài)和受損狀態(tài)之間的分布情況，比較參照狀態(tài)和受損狀態(tài)25th～75th分位數(shù)范圍，保留箱線圖箱體重疊情況≥2的指標(biāo)；

c)相關(guān)性分析：對(duì)步驟b)中保留的指標(biāo)進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，檢驗(yàn)各指標(biāo)反映信息的獨(dú)立性；選常用且代表性強(qiáng)的指標(biāo)作為優(yōu)先保留指數(shù)，剔除掉和優(yōu)先保留指數(shù)高度相關(guān)的指標(biāo)，所述高度相關(guān)是指兩個(gè)指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)|r|大于0.750；所述優(yōu)先保留指數(shù)包括M01_總分類單元數(shù)，M12_顫蚓科_仙女蟲(chóng)科占比，M27_平均遺傳多樣性，M02_軟體動(dòng)物分類單元或M18_軟體動(dòng)物占比；M24_BMWP指數(shù)或M25_ASPT指數(shù)或M26_BI指數(shù)；

d)確定最終指標(biāo)：根據(jù)上述步驟a)、b)、c)確定最終候選指標(biāo)。