[發明專利]一種同時檢測玉米中黃曲霉毒素B1和赤霉烯酮毒素的時間分辨熒光免疫層析方法

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• 申請號: 202110675764.0
• 申請日: 2021-06-13
• 公開（公告）號: CN113533731A
• 公開（公告）日: 2021-10-22
• 發明（設計）人: 王中江;郭增旺;赫志強;韓麗杰;王卓
• 申請（專利權）人: 黑龍江譜尼測試科技有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/558;G01N33/543;G01N33/533;G01N33/53;G01N21/64
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1.一種同時檢測玉米中黃曲霉毒素B1和赤霉烯酮毒素的時間分辨熒光免疫層析方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)時間分辨熒光免疫層析試紙條的制備：采用羧基化熒光微球制備熒光探針，在NC膜上噴涂(0.8μL/cm)包被抗原AFB1-OVA和包被抗原ZEN-OVA分別作為檢測線(T1線和T2線)，羊抗鼠IgG作為質控線(C線)，包被后置于37℃的鼓風干燥箱中烘12h，將樣品墊、吸水紙、NC膜與PVC底板進行組裝，切成寬3mm的試紙條后避光干燥備用。

(2)時間分辨熒光免疫層析試紙條的檢測條件篩選：熒光微球的活化pH(5-7)、偶聯熒光微球的抗體用量(AFB1-單克隆抗體2-5μg，ZEN-單克隆抗體1-6μg)、抗體-熒光探針用量(AFB1-熒光探針2-6μL，ZEN-熒光探針1-5μL)、檢測線上包被抗原濃度(AFB1-OVA 0.2-1.5mg/ml，ZEN-OVA 0.2-2mg/ml)、質控線上羊抗鼠IgG濃度(0.1-0.3mg/ml)。

(3)樣品的檢測：①樣品前處理：玉米粉碎過20目篩，分裝避光保存；②提取溶劑和提取時間的篩選：準確稱取1.0g玉米粉樣品，分別加入5mL提取劑乙酸乙酯、乙腈、無水甲醇和甲醇水，充分振蕩3-10min，室溫離心(4000r/min，5min)；取100μL上清液，用樣品緩沖液稀釋4倍，制得待測樣品液；③檢測分析：取100μL樣品緩沖液或待測樣品液，加入含有熒光探針的微孔中吹打混勻，37℃孵育2-5min；將試紙條插入微孔，37℃反應5-10min，隨后對熒光層析試紙條進行檢測分析。定性分析：在紫外燈下通過肉眼判斷定性結果，當含有一定濃度待測物時，T線不顯線，C線顯紅色熒光，則結果為陽性；相反，當無待測物時T線和C線均顯紅色熒光，結果為陰性。定量分析：反應結束后30s內，將熒光層析試紙條插入熒光讀數儀讀取結果，得到被測玉米中黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒A的含量。

(4)準確度評價：對含有10μg/kg AFB1和110μg/kg ZEN混合溶液的空白玉米樣品，分別采用該時間分辨熒光免疫層析定量分析法和國標的高效液相色譜法兩種檢測方法進行檢測，并對檢測結果的一致性進行分析。

2.根據權利要求1所述的一種同時檢測玉米中黃曲霉毒素B1和赤霉烯酮毒素的時間分辨熒光免疫層析方法，其特征在于：步驟(1)采用羧基化熒光微球制備熒光探針的方法為：將10μL時間分辨熒光微球均勻分散在1mL活化液中，依次加入50μL EDC溶液(0.5mg/mL)和50μL NHS溶液(0.5mg/mL)，超聲混勻，放置搖床振蕩(200r/min)室溫活化10-20min，離心(14000r/min，20min)棄上清；復溶于1mL偶聯緩沖液中，超聲振蕩，使熒光微球重懸；加入抗體，放置搖床振蕩室溫反應20-40min；隨后加入20μL封閉液，放置搖床振蕩室溫封閉反應1h，離心棄上清液；用200μL熒光微球復溶液復溶，4℃保存。

3.根據權利要求1所述的一種同時檢測玉米中黃曲霉毒素B1和赤霉烯酮毒素的時間分辨熒光免疫層析方法，其特征在于：步驟(1)熒光探針的制備方法中時間分辨熒光微球的活化時間為10-20min，加入抗體后的反應時間為20-40min。

4.根據權利要求1所述的一種同時檢測玉米中黃曲霉毒素B1和赤霉烯酮毒素的時間分辨熒光免疫層析方法，其特征在于：步驟(2)時間分辨熒光免疫層析試紙條的檢測條件中熒光微球的活化pH值為5-7。

5.根據權利要求1所述的一種同時檢測玉米中黃曲霉毒素B1和赤霉烯酮毒素的時間分辨熒光免疫層析方法，其特征在于：步驟(2)時間分辨熒光免疫層析試紙條的檢測條件中AFB1單克隆抗體用量為2-5μg，ZEN單克隆抗體用量為1-6μg。

6.根據權利要求1所述的一種同時檢測玉米中黃曲霉毒素B1和赤霉烯酮毒素的時間分辨熒光免疫層析方法，其特征在于：步驟(2)時間分辨熒光免疫層析試紙條的檢測條件中AFB1-熒光探針用量為2-6μL，ZEN-熒光探針用量為1-5μL。