[發(fā)明專(zhuān)利]抗尼帕病毒G蛋白抗體的間接ELISA檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110667511.9
• 申請(qǐng)日: 2021-06-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113391067B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-07-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 金寧一;李昌;高子函;李樂(lè)天;許汪;郝鵬飛;魯會(huì)軍;李霄;田明堯
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/569
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/569;G01N33/543;G01N33/535
• 代理公司: 深圳峰誠(chéng)志合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44525
• 代理人: 陳婷

1.抗尼帕病毒G蛋白抗體的間接ELISA檢測(cè)方法，其特征在于，

以尼帕病毒G蛋白作為抗原包被酶標(biāo)板，拍凈液體，洗滌，封閉，洗滌，加入稀釋后的一抗孵育，拍凈一抗，洗滌，加入酶標(biāo)二抗孵育，拍凈二抗，洗滌，顯色孵育，終止反應(yīng)，獲得OD₄₅₀值；

所述一抗包括陽(yáng)性樣本血清或陰性樣本血清；

所述抗原的包被濃度為2μg/mL～10μg/mL；所述一抗的稀釋度為1：200～1：800；所述一抗的孵育時(shí)間為30min～90min；

所述酶標(biāo)二抗的工作濃度為1:5000～1:20000；所述酶標(biāo)二抗的孵育時(shí)間為30min～120min；

所述封閉具體為：以5％脫脂乳-TBST為封閉液，37℃封閉1.5h；

所述顯色的時(shí)間為5min～20min；

所述抗原的包被濃度為10μg/mL；所述一抗的稀釋度為1：400，所述一抗的孵育時(shí)間為60min；

尼帕病毒G蛋白的制備方法：

尼帕病毒G蛋白序列分析、設(shè)計(jì)以及合成

根據(jù)NCBI上尼帕病毒的28個(gè)全基因組序列，將G蛋白的基因序列進(jìn)行對(duì)比，繪制進(jìn)化樹(shù)，并分析G蛋白的氨基酸同源性；通過(guò)線(xiàn)上疏水性分析工具和抗原決定簇預(yù)測(cè)工具進(jìn)行分析，得到尼帕病毒代表毒株NCBI登錄號(hào)：AF212302.2的G蛋白序列，刪除細(xì)胞質(zhì)尾部區(qū)、跨膜疏水區(qū)以及部分莖區(qū)，僅保留胞外球形頭部區(qū)，通過(guò)設(shè)計(jì)得到的這段序列命名為sG；N端添加人組織纖溶酶原激活物信號(hào)肽序列和Strep標(biāo)簽，兩端分別添加酶切位點(diǎn)HindⅢ和Bam?HⅠ，序列設(shè)計(jì)完成后由上海生工有限公司進(jìn)行密碼子優(yōu)化并合成，得到含有目的基因質(zhì)粒pUC57-NiV-sG的甘油菌；

重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將合成的含有目的基因質(zhì)粒pUC57-NiV-sG的10μL甘油菌接種于5mL帶有氨芐霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)12h，進(jìn)行質(zhì)粒的小量提取制備，Hind?III和Bam?HI雙酶切后連接至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，得到真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-sG，將重組質(zhì)粒采用熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1，經(jīng)氨芐抗性篩選，挑取陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序，序列比對(duì)確認(rèn)無(wú)誤后，大量制備與純化，測(cè)定質(zhì)粒濃度，用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染；

細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前一天，Expi293F細(xì)胞在8％CO₂、37℃和125r/min條件下懸浮培養(yǎng)，將60mL體系的293F細(xì)胞培養(yǎng)物測(cè)定存活率以及活細(xì)胞密度，活細(xì)胞生長(zhǎng)至4.2×10⁶個(gè)/mL,存活率為97％，將細(xì)胞培養(yǎng)物稀釋為2.1×10⁶個(gè)/mL，轉(zhuǎn)染當(dāng)天，細(xì)胞密度為3×10⁶個(gè)/mL，將60μg真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-sG與3mL?Opti-MEM^TM?I?Reduced?Serum?Medium混勻，160μLExpiFectamine^TM?293?Reagent與2.8mL?Opti-MEM^TMI?Reduced?Serum?Medium混勻，室溫孵育5min后將二者混勻繼續(xù)室溫下孵育20min；然后將溶液緩慢轉(zhuǎn)移到的細(xì)胞培養(yǎng)物搖瓶中，在加入過(guò)程中輕輕旋轉(zhuǎn)搖瓶；

收集目的蛋白

轉(zhuǎn)染后12h，加入300μL轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑1和3mL的轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑2，繼續(xù)培養(yǎng)96h，將培養(yǎng)物以800g離心10min，分別收集培養(yǎng)基上清與細(xì)胞沉淀，細(xì)胞沉淀用IP裂解液重懸后冰上裂解10min，使用超聲細(xì)胞破碎機(jī)破碎10min。

2.如權(quán)利要求1所述的間接ELISA檢測(cè)方法，其特征在于，所述酶標(biāo)二抗的稀釋度為1︰20000，所述酶標(biāo)二抗的孵育時(shí)間為30min。

3.如權(quán)利要求1至2任一項(xiàng)所述的間接ELISA檢測(cè)方法，其特征在于，所述顯色的時(shí)間為15min。

4.如權(quán)利要求1至2任一項(xiàng)所述的間接ELISA檢測(cè)方法，其特征在于，Cut-off值為陰性對(duì)照血清OD₄₅₀均值×2.1。