[發明專利]高特異RPA/RAA檢測試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202110664764.0
• 申請日: 2021-06-16
• 公開（公告）號: CN113151409A
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發明（設計）人: 周國華;武海萍;齊謝敏;馬雪萍;陳杉;李博
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍東部戰區總醫院
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 江蘇斐多律師事務所 32332
• 代理人: 張佳妮

1.一種高特異RPA/RAA檢測試劑盒，包括重組酶、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、單鏈DNA結合蛋白，其特征在于：還包括上游寡核苷酸探針、下游寡核苷酸探針、發夾探針及flap核酸內切酶；

所述下游寡核苷酸探針設計為3’端與靶標序列互補，5’端與靶標序列不互補，所述上游寡核苷酸探針與靶標序列互補，上游寡核苷酸探針的3’末端單個堿基侵入到下游寡核苷酸探針與靶標雜交的雙鏈區域，形成flap核酸內切酶識別底物，flap核酸內切酶切割釋放出下游寡核苷酸探針5’端與靶標不互補的部分；

所述發夾探針上標記有熒光基團與淬滅基團，下游寡核苷酸探針5’端與靶標不互補的部分與發夾探針互補，侵入到發夾探針5’雙鏈區域，再次形成flap核酸內切酶識別底物，flap核酸內切酶酶切使熒光基團與淬滅基團分離。

2.根據權利要求1所述的高特異RPA/RAA檢測試劑盒，其特征在于：所述flap核酸內切酶為：Afu FEN1、Pfu FEN1、Mja FEN1或Mth FEN1。

3.根據權利要求2所述的高特異重組酶聚合酶核酸擴增檢測試劑盒，其特征在于：所述flap核酸內切酶為Afu FEN1。

4.根據權利要求1所述的高特異RPA/RAA檢測試劑盒，其特征在于：所述發夾探針5’端標記有熒光基團和淬滅基團，所述熒光基團選自FAM、HEX、TET、JOE、TAMRA、Cy5或Cy3，所述淬滅基團選自DABCYL、ECLIPSE、TAMRA或BHQ。

5.根據權利要求1-4中任一項所述的高特異RPA/RAA檢測試劑盒，其特征在于：所述發夾探針上的熒光基團和淬滅基團間隔1～6個堿基,flap核酸內切酶的酶切位點在間隔堿基上。

6.根據權利要求1所述的高特異RPA/RAA檢測試劑盒，其特征在于：RPA/RAA檢測試劑盒包含以下成分：120ng/μL T4 UvsX蛋白、60ng/μL T4 UvsY蛋白、600ng/μL T4 gp32蛋白、30ng/μL Bsu聚合酶或8～13ng/μL Sau聚合酶、800μM脫氧核糖核苷酸(dNTP)、150nM～600nM上下游寡核苷酸擴增引物、5％聚乙二醇35000、2mM二硫蘇糖醇、50mM磷酸肌酸、100ng/μL肌酸激酶、3mM三磷酸腺苷、pH7.9的50mM Tri-醋酸、20～100mM乙酸鉀、14mM乙酸鎂、0.1～0.5μM上下游寡核苷酸探針與發夾探針、50～500ng/μL flap核酸內切酶。

7.一種高特異RPA/RAA檢測方法，其特征在于其步驟包括：

(1)根據待測靶標的DNA序列設計寡核苷酸引物、上游寡核苷酸探針、下游寡核苷酸探針及發夾探針并合成，提取待測樣本的基因組DNA；

(2)在待測樣本的基因組DNA中加入權利要求1-6中任一項所述的高特異RPA/RAA檢測試劑盒中的重組酶、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、單鏈DNA結合蛋白、上游寡核苷酸探針、下游寡核苷酸探針、發夾探針及flap核酸內切酶，控制溫度先進行DNA擴增反應；

(3)待DNA擴增反應完成后，調整溫度，進行flap核酸內切酶切割反應，檢測反應過程中是否有熒光信號發生，若檢測到熒光信號則說明待測樣本中存在靶標DNA。

8.根據權利要求7所述的高特異RPA/RAA檢測方法，其特征在于：步驟(2)中擴增反應的溫度為30～45℃。

9.根據權利要求8所述的高特異RPA/RAA檢測方法，其特征在于：步驟(2)中擴增反應的時間為10～30min。

10.根據權利要求7所述的高特異RPA/RAA檢測方法，其特征在于：步驟(3)中flap核酸內切酶切割反應的溫度為63℃，步驟(3)中flap核酸內切酶切割反應的時間為5～30min。