[發明專利]一種森林腦炎病毒裝甲RNA標準物質及其制備方法

在審

• 申請號: 202110663363.3
• 申請日: 2021-06-16
• 公開（公告）號: CN113480661A
• 公開（公告）日: 2021-10-08
• 發明（設計）人: 馬思杰;胡群;童淑梅;鄒春穎
• 申請（專利權）人: 寧波檢驗檢疫科學技術研究院
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理有限公司 33226
• 代理人: 何仲

1.一種森林腦炎病毒裝甲RNA標準物質，其特征在于：該裝甲RNA的表達載體為pET32a-CP-C質粒，質粒包含噬菌體MS2 CP蛋白序列片段以及森林腦炎病毒C蛋白序列片段。

2.一種森林腦炎病毒裝甲RNA標準物質的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）噬菌體MS2 CP基因擴增

根據噬菌體MS2 CP蛋白序列片段設計特異性擴增引物，擴增引物序列如下所示：CPP1：5′-GGTACCGGGTGGGACCCCTTTCGGGGTCCTG-3′，CP P2：5′-TTCCAGTAGCGACAGAAGCAAAAGCTTCC-3′ ；以MS2 噬菌體序列片段質粒為載體，通過引物CPP1和引物CP P2擴增獲得噬菌體MS2 CP基因，其基因序列如SEQ ID NO:3所示；

（2）表達載體pET32a-CP的構建

將PCR擴增產物噬菌體MS2 CP基因和原核表達載體pET-32a雙酶切，使用質粒純化試劑盒純化回收目的片段后并連接，將連接質粒轉化感受態細胞進行藍白斑篩選，在轉化的LB平板上挑取白色克隆，接種于LB液體培養基，37℃過夜培養，提取質粒獲得表達載體pET32a-CP；

（3）森林腦炎病毒C蛋白序列合成

人工合成森林腦炎病毒衣殼蛋白C基因組序列，并在序列5’端和3’端分別插入BamHI和Not I酶切位點，序列如SEQ ID NO:4所示，將合成的森林腦炎病毒衣殼蛋白C插入到pBluescript II SK+載體中，獲得目的序列片段pBSK-C；

（4）表達載體pET32a-CP-C構建

將pET32a-CP和pBSK-C均使用BamHI 、Not I雙酶切，1.5wt%瓊脂糖凝膠電泳，使用膠回收試劑盒回收pET32a-CP和森林腦炎病毒衣殼蛋白C序列片段，連接后轉化DH5α感受態細胞進行藍白斑篩選，在轉化的LB平板上挑取白色克隆，接種于LB液體培養基，37℃過夜培養，提取質粒獲得森林腦炎病毒裝甲RNA表達載體 pET32a-CP-C；

（5）森林腦炎病毒裝甲RNA制備

將森林腦炎病毒裝甲RNA表達載體 pET32a-CP-C轉入大腸桿菌原核表達菌株BL21中，誘導表達，離心收集菌體，超聲波破碎后離心取上清，即獲得森林腦炎病毒裝甲RNA標準物質。

3.根據權利要求2所述的一種森林腦炎病毒裝甲RNA標準物質的制備方法，其特征在于步驟（2）具體為：將PCR擴增產物噬菌體MS2 CP基因和原核表達載體pET-32a雙酶切， 37℃酶切1h，使用質粒純化試劑盒純化回收酶切后的目的片段，用DNA 連接試劑盒連接，連接體系：Ligation MiX 10μL、CP 8μL，pET32a 2μ，4℃過夜反應，將連接質粒轉化感受態細胞進行藍白斑篩選，在轉化的LB平板上挑取白色克隆，接種2mL 于LB液體培養基，37℃過夜培養，提取質粒，即得到表達載體pET32a-CP，其中酶切反應體系如下：10 ×K Buffer 1μL、15units/μL BamHI 1μL 、10units/μL Kpn I 1μL，PCR產物/pET32a質粒1μL，DDw 16μL，37℃酶切1h。

4.根據權利要求2所述的一種森林腦炎病毒裝甲RNA標準物質的制備方法，其特征在于步驟（4）具體為：將pET32a-CP和pBSK-C質粒使用BamHI 、Not I雙酶切，1.5wt%瓊脂糖凝膠電泳，使用膠回收試劑盒回收森林腦炎病毒衣殼蛋白C片段以及pET32a-CP片段，將酶切回收的蛋白C片段和pET32a-CP片段連接，連接條件反應體系：Ligation MiX 10μL、pET32a-CP2μL，C 8μL，4℃過夜反應；將連接質粒轉化DH5α感受態細胞進行藍白斑篩選，在轉化的LB平板上挑取白色克隆，接種2mL于 LB液體培養基，37℃過夜培養后提取質粒，用pET32a T7上下游引物T7擴增目的片段并測序，得到pET32a-CP-C質粒；其中雙酶切反應體系如下：10 ×K Buffer 1μL、15units/μL BamHI酶 1μL 、10units/μL Not I酶 1μL， 0.1% BSA 1μL，質粒10μL，雙蒸水 6μL，37℃酶切3h。

5.根據權利要求2所述的一種森林腦炎病毒裝甲RNA標準物質的制備方法，其特征在于步驟（5）具體為：將質粒pET32a-CP-C轉化BL21（DE3）菌株，藍白斑篩選挑取陽性菌株并用pET32a T7引物PCR擴增鑒定，按1:100的體積比將陽性菌株轉接種2mL 2×YT液體培養基，37℃ 200rpm搖4h后，加入IPTG使其終濃度為1mM，誘導5h后，終止培養，離心收集菌體，超聲波破碎后離心取上清，，即得到森林腦炎病毒裝甲RNA標準物質。