[發(fā)明專利]新型冠狀病毒NSP13基因的用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110662421.0
• 申請(qǐng)日: 2021-06-15
• 公開（公告）號(hào): CN113388626B
• 公開（公告）日: 2022-10-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 夏宇塵;李艾欣;張蓓
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/50
• 分類號(hào): C12N15/50;C12N15/79;C07K14/165
• 代理公司: 武漢智權(quán)專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42225
• 代理人: 馬麗娜

本發(fā)明提供了新型冠狀病毒NSP13基因的新用途，將新型冠狀病毒NSP13基因制備成允許表達(dá)SARS?CoV?2NSP13蛋白的產(chǎn)品，其在真核細(xì)胞中表達(dá)的SARS?CoV?2NSP13蛋白，可以顯著性地抑制真核表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)，且SARS?CoV?2NSP13蛋白只抑制真核表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)，但不抑制真核細(xì)胞基因組中基因的表達(dá)，進(jìn)一步地，SARS?CoV?2NSP13蛋白是在mRNA水平抑制真核表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)。本發(fā)明利用該發(fā)現(xiàn)首次將外源性蛋白引入真核細(xì)胞內(nèi)用于抑制真核表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)，填補(bǔ)了之前對(duì)于外源質(zhì)粒表達(dá)調(diào)控的技術(shù)上的空缺，為抑制細(xì)胞中游離基因的表達(dá)提出了新的思路。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及新型冠狀病毒NSP13基因的新用途。

背景技術(shù)

對(duì)于大多數(shù)RNA病毒來講，病毒RNA通常會(huì)在一些非翻譯區(qū)或者是開放讀碼框(ORF)序列形成多種順式作用元件，以在病毒的復(fù)制周期中發(fā)揮重要的作用。SARS-CoV-2作為一種有包膜的正鏈RNA病毒，它的非結(jié)構(gòu)蛋白NSP13包含601個(gè)的氨基酸，是一種具有三磷酸核苷水解酶(NTPase)活性和RNA解旋酶活性的蛋白，也是構(gòu)成病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制機(jī)器的兩個(gè)核心組分之一。SARS-CoV-2NSP13整體結(jié)構(gòu)類似于重癥急性呼吸綜合征(SARS)和中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS)的NSP13蛋白，呈金字塔狀，由以下五個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：N端的鋅指結(jié)構(gòu)域(ZBD)和stalk結(jié)構(gòu)域、1B結(jié)構(gòu)域以及C端的解旋酶核心部分Rec A1和Rec A2結(jié)構(gòu)域。在病毒的生活周期中，NSP13發(fā)揮其解旋酶活性將雙鏈RNA解開進(jìn)行下一輪RNA復(fù)制。在冠狀病毒的進(jìn)化過程中，NSP13蛋白表現(xiàn)出很高的保守性，目前NSP13具體以什么機(jī)制發(fā)揮生物學(xué)功能暫時(shí)還不太清楚，所以對(duì)NSP13蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的研究是非常重要的。

在1952年，美國的生物學(xué)家J.萊德伯格第一次引入質(zhì)粒(plasmid)這個(gè)術(shù)語，即用來表述染色體以外的基因物質(zhì)。質(zhì)粒廣泛存在于生物界，從細(xì)菌、真菌到植物甚至哺乳動(dòng)物。已知的絕大多數(shù)質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈DNA(共價(jià)閉環(huán)DNA,covalently closed circularDNA,cccDNA)，具有自主復(fù)制能力，可以在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并且表達(dá)所攜帶的遺傳信息。對(duì)于一個(gè)質(zhì)粒，最簡(jiǎn)單的形式包括一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)(Origin ofreplication,ORI)負(fù)責(zé)質(zhì)粒的復(fù)制起始，一段抗性基因用來快速篩選以及至少一個(gè)酶切位點(diǎn)便于外源基因的插入，這些元件可以保證質(zhì)粒在細(xì)菌內(nèi)擴(kuò)增，同時(shí)允許攜帶質(zhì)粒的細(xì)菌從不含質(zhì)粒的細(xì)菌中分離出來，而酶切位點(diǎn)可以使外源DNA片段插入到質(zhì)粒中。

正因?yàn)橘|(zhì)粒這些特殊的屬性，在遺傳工程研究中常被用作運(yùn)送外源基因的載體，近些年來，質(zhì)粒載體在基因治療中的應(yīng)用已引起人們的關(guān)注，并有了很大的進(jìn)展，與病毒載體相比，質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)是制備簡(jiǎn)單、成本低廉、快捷，而且比較安全，能與其他合成載體聯(lián)合使用。由于有些治療不需要長期的一個(gè)外源基因的導(dǎo)入，或者是在治療過程中出現(xiàn)外源核酸污染情況，而現(xiàn)有的技術(shù)無法靈活地消除外源基因。并且在生物界，一些質(zhì)粒具有致病性，比如使昆蟲致病甚至死亡的細(xì)菌毒素就是質(zhì)粒編碼的；還有一些質(zhì)粒賦予宿主產(chǎn)生抗藥性遺傳，使宿主對(duì)抗生素、化學(xué)藥物、重金屬等殺菌劑表現(xiàn)出抗性，會(huì)阻止抗菌素進(jìn)入細(xì)胞或者修飾抗菌素使其失活，甚至改變抗菌素作用的靶位點(diǎn)或者自身產(chǎn)生能代替宿主細(xì)胞中被抗菌素作用的靶酶，所以對(duì)于這一部分的質(zhì)粒如何進(jìn)行一個(gè)復(fù)制轉(zhuǎn)錄層面的負(fù)調(diào)控作用就顯得尤為重要，這就需要根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求發(fā)明不同的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

檢測(cè)和降解外來核酸是一種古老的宿主防御方式。然而，其根本機(jī)制尚不完全清楚。通常宿主細(xì)胞面對(duì)外源病毒或者轉(zhuǎn)染基因的DNA或者RNA時(shí)，會(huì)觸發(fā)其天然免疫信號(hào)，激活DNA感受器即一些toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)或者RNA感受器RIG樣受體，從而引起一些抗病毒蛋白的上調(diào)，如一些核酸酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶等降解外源核酸，而這些抗病毒蛋白往往是由宿主基因控制的，目前沒有報(bào)道過外源性蛋白可以在過表達(dá)的情況下抑制外源質(zhì)粒的表達(dá)。因此，如何引入外源性蛋白抑制外源質(zhì)粒的表達(dá)是一個(gè)亟待深入研究的課題。

發(fā)明內(nèi)容