[發明專利]高效鑒定米曲霉CRISPR/Cas9突變體的方法

在審

• 申請號: 202110661531.5
• 申請日: 2021-06-15
• 公開（公告）號: CN113403208A
• 公開（公告）日: 2021-09-17
• 發明（設計）人: 張哲;張煥欣;曾斌;李玉珍;陳梓銘;范俊俠
• 申請（專利權）人: 江西科技師范大學;江西省農業科學院園藝研究所
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/80;C12N15/65;C12Q1/04;C12R1/69
• 代理公司: 蘇州中合知識產權代理事務所(普通合伙) 32266
• 代理人: 劉召民

本發明提供了高效鑒定米曲霉CRISPR/Cas9突變體的方法，包括：1)構建基于AMA1自主復制質粒的米曲霉基因編輯系統；2)利用米曲霉曲酸合成基因評估步驟1)構建的米曲霉基因編輯系統，所述米曲霉曲酸合成基因選自kojA、kojR和kojT；3)將kojA的sgRNA和PAM序列置于DsRed的起始密碼子后面，構建含有kojA的sgRNA和PAM序列的非功能性DsRed，以此評估非功能性DsRed作為報告基因用于篩選米曲霉CRISPR/Cas9突變體。本發明實現了從米曲霉CRISPR/Cas9突變株中批量的初步篩選突變體，避免了大量提取DNA的繁瑣，無需進行批量的米曲霉轉化子測序篩選。

技術領域

本發明涉及生物技術的基因工程領域，具體涉及高效鑒定米曲霉CRISPR/Cas9突變體的方法。

背景技術

米曲霉廣泛用于食品發酵、酶及次級代謝產物的工業生產。基因工程技術的發展極大地提高了米曲霉的產品質量和產量，其中CRISPR/Cas9系統為米曲霉的基因改造提供了強大的基因工程工具。CRISPR/Cas9系統包含兩個組成部分：Cas9核酸酶和一個sgRNA。sgRNA可以引導Cas9核酸酶識別并切割位于原間隔基序(protospacer adjacent motif，PAM)上游的靶序列。當Cas9產生的DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand breaks，DSB)通過非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)機制或同源定向修復(homology-directed repair，HDR)機制修復時，靶位點會產生核苷酸的隨機插入或缺失(insertionsor deletions，InDels)。CRISPR/Cas9系統已廣泛應用于米曲霉、黑曲霉、棘孢曲霉等各種絲狀真菌。然而，為了滿足工業化生產和功能研究的需求，需要對CRISPR/Cas9系統產生的突變體進行快速篩選。

目前突變體的鑒定方法主要是基于PCR、限制性內切酶和測序技術。例如，PCR/限制性內切酶(PCR/RE)分析需要擴增和消化靶位點中可用的限制性內切酶位點，一旦靶位點中的限制性內切酶位點被編輯破壞掉，就會引起靶位點的無法酶切而鑒定出突變體。類似地，T7EI分析方法利用了噬菌體分解酶T7EI，該酶對通過CRISPR/Cas9基因編輯引入的靶位點的錯配具有更大的切割活性，從而鑒定出突變體。雖然這些測序可以準確鑒定突變體的突變類型，但是批量篩選突變體的成本高、難度大。直接觀察材料的熒光是快速鑒定突變體的一個好方法。已有研究報道，利用綠色熒光蛋白(green fluorescence protein，GFP)報告基因與Cas9編碼基因融合來獲得轉化材料，但僅憑熒光不能將轉化材料與大量未轉化材料區分開來。因此，非常有必要建立一種高效的方法來鑒定CRISPR/Cas9產生的突變體。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供了高效鑒定米曲霉CRISPR/Cas9突變體的方法。

為了實現上述技術目的，本發明采用以下技術方案：

高效鑒定米曲霉CRISPR/Cas9突變體的方法，包括：

1)構建基于AMA1自主復制質粒的米曲霉基因編輯系統；

2)利用米曲霉曲酸合成基因評估步驟1)構建的米曲霉基因編輯系統，所述米曲霉曲酸合成基因選自kojA、kojR和kojT；

3)將kojA的sgRNA和PAM序列置于DsRed的起始密碼子后面，構建含有kojA的sgRNA和PAM序列的非功能性DsRed，以此評估非功能性DsRed作為報告基因用于篩選米曲霉CRISPR/Cas9突變體。

優選地，步驟1)又包括：

1-1)將優化的Cas9基因序列插入到pEX1載體的XhoI和BamHI識別位點之間，得到pEX1-Cas9載體；