[發明專利]一種甲氨蝶呤代謝標志物的檢測試劑盒及其檢測方法和應用

在審

• 申請號: 202110661230.2
• 申請日: 2021-06-15
• 公開（公告）號: CN113528629A
• 公開（公告）日: 2021-10-22
• 發明（設計）人: 孫悅;劉丹
• 申請（專利權）人: 湖南菲思特精準醫療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 湖南喬熹知識產權代理事務所(普通合伙) 43262
• 代理人: 安曼

1.一種甲氨蝶呤代謝標志物的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒用于檢測氨甲喋呤代謝標志物ABCB1(C3435T)、MTHFR(C677T)和SLCO1B1(c.1865+4846TC)基因多態性，試劑盒包括如下組分：ABCB1(C3435T)擴增引物、ABCB1(C3435T)測序引物、MTHFR(C677T)擴增引物、MTHFR(C677T)測序引物、SLCO1B1(c.1865+4846TC)擴增引物、SLCO1B1(c.1865+4846TC)測序引物和陽性對照。

2.根據權利要求1所述的甲氨蝶呤代謝標志物的檢測試劑盒，其特征在于，所述ABCB1(C3435T)擴增引物如序列表SEQ ID NO:1～2所示。

3.根據權利要求1所述的甲氨蝶呤代謝標志物的檢測試劑盒，其特征在于，所述MTHFR(C677T)測序引物如序列表SEQ ID NO:3～4所示。

4.根據權利要求1所述的甲氨蝶呤代謝標志物的檢測試劑盒，其特征在于，所述SLCO1B1(c.1865+4846TC)擴增引物如序列表SEQ ID NO:5～6所示。

5.根據權利要求1所述的甲氨蝶呤代謝標志物的檢測試劑盒，其特征在于，所述ABCB1(C3435T)測序引物如序列表SEQ ID NO:7所示，MTHFR(C677T)測序引物如序列表SEQ IDNO:8所示，SLCO1B1(c.1865+4846TC)測序引物如序列表SEQ ID NO:9所示。

6.根據權利要求1所述的甲氨蝶呤代謝標志物的檢測試劑盒，其特征在于，所述測序引物為瓊脂糖凝膠顆粒與氨基標記的DNA序列的結合物。

7.根據權利要求1所述的甲氨蝶呤代謝標志物的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括擴增緩沖液、18mM醋酸鎂、dNTPS、鏈置換DNA聚合酶、單鏈DNA結合蛋白、結合單鏈核酸的重組酶和海藻糖。

8.根據權利要求1所述的甲氨蝶呤代謝標志物的檢測試劑盒，其特征在于，所述的陽性對照包括濃度為20ng/ul的ABCB1(C3435T)、MTHFR(C677T)、SLCO1B1(c.1865+4846TC)雜合型基因組DNA。

9.一種采用根據權利要求1～8任一項所述的甲氨蝶呤代謝標志物的檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測方法包括以下步驟：

a.將所述擴增反應液與5ul待測基因組DNA，采用多重RPA擴增進行擴增；

b.結合液(含微珠)與擴增產物進行結合；

c.變性液處理得到單鏈產物；

d.加入洗滌緩沖液漂洗；

e.向每個測序管中加入測序酶和測序底物；

f.取一個8排管，自圓滑一端向平端依次加入dATP、dTTP、dGTP、dCTP、ABCB1(C3435T)測序引物、MTHFR(C677T)測序引物、SLCO1B1(c.1865+4846TC)測序引物、ddGTP、ddCTP；

g.焦磷酸測序；

h.確定ABCB1(C3435T)位點、MTHFR(C677T)位點、SLCO1B1(c.1865+4846TC)位點甲氨喋呤藥物劑量及不良反應位點的基因型。

10.一種根據權利要求1～8任一項所述的甲氨蝶呤代謝標志物的檢測試劑盒的應用，其特征在于，所述檢測試劑盒用于體外檢測待測樣本中的ABCB1(C3435T)、MTHFR(C677T)和SLCO1B1(c.1865+4846TC)基因多態性。