[發(fā)明專利]一組用于釀酒酵母多拷貝整合的質(zhì)粒工具包

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110659681.2
• 申請日: 2021-06-11
• 公開（公告）號(hào): CN113403334B
• 公開（公告）日: 2023-10-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周景文;高松;曾偉主;陳堅(jiān);沐萬孟
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/81
• 分類號(hào): C12N15/81;C12N1/19;C12P17/06;C12R1/865
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 趙巧娜

1.釀酒酵母多拷貝整合基因表達(dá)框，其特征在于，所述表達(dá)框由弱啟動(dòng)子序列和帶有降解標(biāo)簽deg的篩選基因序列組成；所述弱啟動(dòng)子包括P_ADE6、P_LEU2、P_URA3、P_PMA1、P_ZWF1、P_ARO7、P_PYC1、P_ADE3、P_YEF3、P_ERG1，所述篩選基因包括ScTRP1、KlLEU2、KlURA3、ScMET15、SpHIS5、natMX、hphMX、kanMX、patMX、bleMX。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因表達(dá)框，其特征在于，所述弱啟動(dòng)子P_ADE6、P_LEU2、P_URA3、P_PMA1、P_ZWF1、P_ARO7、P_PYC1、P_ADE3、P_YEF3、P_ERG1，的核苷酸分別如SEQ ID NO.1～10所示；所述篩選基因帶有降解標(biāo)簽，與降解標(biāo)簽共同組成的核苷酸序列如SEQ ID NO.11～20所示。

3.釀酒酵母多拷貝整合質(zhì)粒，其特征在于，由權(quán)利要求1或2所述的基因表達(dá)框和預(yù)整合表達(dá)框組成；所述預(yù)整合表達(dá)框由Ty轉(zhuǎn)座子的上下游同源臂序列、終止子序列及綠色熒光蛋白表達(dá)框組成。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的釀酒酵母多拷貝整合質(zhì)粒，其特征在于，所述Ty轉(zhuǎn)座子序列包括Ty1Cons、Ty2Cons、Ty3Cons、Ty4Cons和Ty5Cons；所述終止子包括T_RFC5-T_POL30、T_SEC13-T_PNP1、T_MTD1-T_RPF2、T_LEU2-T_NFS1、T_DSF1-T_HXT13、T_TIM21-T_GSC2、T_RRP12-T_TAF3、T_RNA14-T_BUB2、T_ADH1、和T_CYC1。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的釀酒酵母多拷貝整合質(zhì)粒，其特征在于，按照上游同源臂、綠色熒光蛋白表達(dá)框、終止子序列、基因表達(dá)框、下游同源臂的順序連接。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的釀酒酵母多拷貝整合質(zhì)粒，其特征在于，所述綠色熒光蛋白表達(dá)框包括一個(gè)啟動(dòng)子P_GAL7，啟動(dòng)子P_GAL7的上游包含一個(gè)終止子序列T_GAL10。

7.一種生產(chǎn)黃杉素的菌株，所述菌株通過權(quán)利要求3～6任一所述釀酒酵母多拷貝整合質(zhì)粒表達(dá)生產(chǎn)黃杉素的相關(guān)的基因，所述基因通過如下三個(gè)模塊進(jìn)行表達(dá)：

模塊一：過表達(dá)從酪氨酸或苯丙氨酸到對香豆酸合成的相關(guān)基因：

從酪氨酸到對香豆酸基因包括ARO4^fbr、ARO7^fbr、FjTAL、EcaroL；

從苯丙氨酸到對香豆酸基因包括ARO4^fbr、ARO7^fbr、FjTAL、EcaroL、SmPAL、SmC4H；

模塊二：過表達(dá)從對香豆酸到柚皮素生產(chǎn)相關(guān)基因，所述基因包括Pc4CL、PhCHS和MsCHI；

模塊三：柚皮素到黃杉素合成的相關(guān)基因，所述基因包括SmF3′H、SmCPR和SmF3H。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述菌株，其特征在于，所述菌株以釀酒酵母C800為出發(fā)菌株。