[發(fā)明專利]一種生物合成2-苯乙醇的谷氨酸棒桿菌、構(gòu)建方法及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110656817.4
• 申請(qǐng)日: 2021-06-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113493760B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱年青;夏文靜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 泰州學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12P7/22;C12N15/77;C12R1/15
• 代理公司: 南京禹為知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 32272
• 代理人: 劉小莉

本發(fā)明公開(kāi)了一種生物合成2?苯乙醇的谷氨酸棒桿菌、構(gòu)建方法及應(yīng)用，構(gòu)建方法包括，敲除所述受體菌的cg0641基因或抑制所述cg0641基因的表達(dá)或抑制所述cg0641基因編碼的蛋白質(zhì)的活性，獲得突變株P(guān)E1；增加所述突變株P(guān)E1中酮酸脫羧酶編碼基因編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)量或增強(qiáng)所述酮酸脫羧酶編碼基因編碼蛋白質(zhì)的活性，獲得突變株P(guān)E2；增加所述突變株P(guān)E2中酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶編碼基因和醇脫氫酶編碼基因編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)量或增強(qiáng)轉(zhuǎn)氨酶基因和醇脫氫酶編碼基因編碼蛋白質(zhì)的活性，獲得突變株P(guān)E3。本發(fā)明所構(gòu)建的高產(chǎn)2?苯乙醇的谷氨酸棒桿菌安全，且克服了現(xiàn)有的菌株生產(chǎn)效率低、耐受性缺陷等缺點(diǎn)，該菌株可以利用葡萄糖和秸稈水解液好氧發(fā)酵生產(chǎn)2?苯乙醇，發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到5.3g/L。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種生物合成2-苯乙醇的谷氨酸棒桿菌、構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

2-苯乙醇是一種具有玫瑰花香味的芳香醇,在化妝品、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。目前，生產(chǎn)2-苯乙醇的方法有化學(xué)合成法、植物提取法和生物合成法。化學(xué)合成法以石油基苯或苯乙烯為原料，不但原料具有致癌風(fēng)險(xiǎn)，而且產(chǎn)物中常含有一些難以去除的副產(chǎn)物，嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量，從而限制其使用范圍；植物提取法和生物合成法生產(chǎn)的2-苯乙醇具有很好的生物安全性，且被認(rèn)定為“天然”級(jí)，因此市場(chǎng)需求量日益增加。然而，從植物中提取2-苯乙醇生產(chǎn)周期長(zhǎng)、成本高，無(wú)法進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，生物合成法作為一種原料可再生和環(huán)境友好型的制造方式能從根本上解決化學(xué)合成和提取方法的弊端。

目前，能合成2-苯乙醇的微生物細(xì)胞工廠主要有兩類：第一類是釀酒酵母，另外一類是通過(guò)代謝工程改造的大腸桿菌。釀酒酵母生物合成2-苯乙醇主要通過(guò)2種途徑：艾氏途徑和莽草酸途徑，艾氏途徑合成2-苯乙醇僅需要3步反應(yīng)，代謝途徑短，是提高2-苯乙醇產(chǎn)量的關(guān)鍵途徑。然而，釀酒酵母合成2-苯乙醇周期較長(zhǎng)，其生產(chǎn)率相對(duì)較低，因此，有研究者對(duì)生長(zhǎng)速度較快、遺傳背景清晰的大腸桿菌進(jìn)行改造用于2-苯乙醇的合成。以E.coliMG1655為出發(fā)菌株，共表達(dá)芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因aro8、2-酮酸脫羧酶編碼基因kdc和醇脫氫酶編碼基因yigB，2-苯乙醇發(fā)酵產(chǎn)量提高到0.28g/L。在大腸桿菌中利用谷氨酸脫氫酶設(shè)計(jì)一個(gè)“橋梁”構(gòu)建輔因子自平衡的細(xì)胞工廠，無(wú)需外源添加任何輔因子，細(xì)胞催化效率提高近4倍，實(shí)現(xiàn)了苯丙氨酸高效轉(zhuǎn)化為2-苯乙醇。盡管多種代謝工程改造策略的應(yīng)用，2-苯乙醇發(fā)酵產(chǎn)量還處于較低水平，這是由于高濃度的2-苯乙醇會(huì)抑制菌株的生長(zhǎng)。2g/L的2-苯乙醇可以完全抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)，4g/L的2-苯乙醇幾乎完全抑制釀酒酵母的生長(zhǎng)。選育或者改造獲得耐受性優(yōu)異的高產(chǎn)細(xì)胞工廠是降低生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)量的有效途徑。

谷氨酸棒桿菌是一種重要的工業(yè)微生物菌種，具有耐受高強(qiáng)度發(fā)酵的魯棒性、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，已被廣泛用于氨基酸的工業(yè)發(fā)酵，以及有機(jī)酸、核苷酸和醇類等生物基化學(xué)品的制造。此外，其對(duì)木質(zhì)纖維素糖化液中芳香族化合物的降解及耐受能力與一般的工業(yè)微生物菌種相比有著明顯的優(yōu)勢(shì)，因此能較好地利用木質(zhì)纖維素類等可再生原料。目前，利用谷氨酸棒桿菌作為宿主構(gòu)建細(xì)胞工廠生物合成2-苯乙醇還未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本部分的目的在于概述本發(fā)明的實(shí)施例的一些方面以及簡(jiǎn)要介紹一些較佳實(shí)施例。在本部分以及本申請(qǐng)的說(shuō)明書(shū)摘要和發(fā)明名稱中可能會(huì)做些簡(jiǎn)化或省略以避免使本部分、說(shuō)明書(shū)摘要和發(fā)明名稱的目的模糊，而這種簡(jiǎn)化或省略不能用于限制本發(fā)明的范圍。

鑒于上述和/或現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，提出了本發(fā)明。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：一種生物合成2-苯乙醇的谷氨酸棒桿菌的構(gòu)建方法，包括，

敲除所述受體菌的短鏈脫氫酶編碼基因或抑制所述短鏈脫氫酶編碼基因的表達(dá)或抑制所述短鏈脫氫酶編碼基因編碼的蛋白質(zhì)的活性，獲得突變株P(guān)E1；

增加所述突變株P(guān)E1中酮酸脫羧酶編碼基因編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)量或增強(qiáng)所述酮酸脫羧酶編碼基因編碼蛋白質(zhì)的活性，獲得突變株P(guān)E2；