[發明專利]一種奶牛乳腺酸化代謝調控分析的方法

在審

• 申請號: 202110653444.5
• 申請日: 2021-06-11
• 公開（公告）號: CN113373239A
• 公開（公告）日: 2021-09-10
• 發明（設計）人: 蔡杰;王迪銘;劉建新;臧新威
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6809;G06K9/62
• 代理公司: 合肥方舟知識產權代理事務所(普通合伙) 34158
• 代理人: 吳偉晨

1.一種奶牛乳腺酸化代謝調控機制分析的方法，其步驟如下所述：

S1:對不同乳腺酸化程度的乳腺組織進行采集并測序，以獲取參與乳腺酸化代謝調節的關鍵基因16個；

S2:通過實時熒光定量PCR的方法進一步比較不同酸化程度乳腺中上述16個關鍵基因的表達量，以確定所篩選的關鍵基因對乳腺酸化的真實貢獻率；

S3:建立乳腺酸化動態關聯分析模型，以上述獲得的乳酸代謝關鍵基因為富集節點，并從全局網絡中提取直接相連的一級網絡節點；

S4:對所提取的乳腺酸化動態關聯分析網絡進行動態生物標記驗證；

S5:根據皮爾森相關系數獲得在不同乳腺酸化情況下的基因間相互關系網絡；

S6:通過網絡拓撲學分析確定不同乳腺酸化程度下酸化動態關聯分析網絡的變化，包括節點數、連接數、平均度和平均聚類系數等參數；

S7:利用動態關聯分析鑒定奶牛乳腺酸化程度和過度乳酸積累的代謝成因。

2.根據權利要求1所述的一種奶牛乳腺酸化代謝調控分析的方法，在所述S1中，所述測序方法如下所述：

乳腺組織樣本通過TissueLyserII和不含RNA酶的陶瓷珠進行均質，對均質后的組織樣本進行總RNA提取并對RNA進行RIN值檢測以確定其完整性(RIN7)，用含Oligo(dT)的磁珠富集帶poly-A尾巴的真核mRNA；

洗脫結合的mRNA，并用隨機引物進行逆轉錄過程，實現cDNA第一鏈的合成，用RNaseH消化雜合雙鏈中的mRNA鏈，并合成cDNA的第二鏈。雙鏈cDNA磁珠純化后，在3’端加入堿基“A”并連接，并選擇片段大小；

PCR擴增后進行mRNA測序。乳腺酸化代謝調節的關鍵基因獲取方法如下：基于基因表達數據算法的差異共表達分析，對獲得的不同酸化程度乳腺組織的轉錄表達譜進行差異共表達分析，以獲得差異共表達基因和差異共表達基因對；

基于獲得的差異共表達基因和差異共表達基因對，構建乳腺酸化代謝調節的全局共表達網絡；

對獲得的全局共表達網絡進行無標度網絡檢驗，以確定全局網絡內是否含有關鍵基因；

當全局網絡為無標度網絡時，該網絡包含大量鏈接較少的網絡節點(即網絡中的基因)，以及少量鏈接很多的關鍵基因，隨后，從全局共表達網絡中，將通過Cytoscape的jActiveModules功能計算獲得的同一模塊中的基因設置為一個基因集，特定基因集之間的蛋白-蛋白相互作用網絡根據string(https://string-db.org/)和intAct(https://www.ebi.ac.uk/intact/)數據庫確定；

結合PPI網絡進行Keydriver分析，尋找給定基因集的重要基因，基于全局共表達網絡中的差異共表達基因對，如果一個基因的臨近基因在其上顯著富集，則被定義為候選關鍵基因，然后，我們將該基因集定位到PPI網絡中，并檢索到候選關鍵基因的直接連接基因，形成候選關鍵基因的鄰近子網絡，卡方檢驗用于評價子網絡基因的富集程度，若Bonferroni校正的候選關鍵基因富集的P值小于0.05，則該基因被定義為關鍵基因；

然后，通過利用關鍵基因與表型的關聯以及與乳腺酸化相關的差異表達，進一步對關鍵基因進行排序，獲得與乳腺酸化相關的基因16個，分別為ABCA3、ADAMTS1、AMD1、ARG2、BAX、DQX1、EIF2AK2、FASN、HEXB、HSPA5、HSPA8、KLHL42、MAML3、MAP3K14、NFKB2、PFKP。

3.根據權利要求1所述的一種奶牛乳腺酸化代謝調控分析的方法，在所述S4中，驗證條件為：

a:乳腺酸化動態關聯分析網絡內部基因的mRNA表達的平均皮爾森相關系數的絕對值顯著增加；

b:乳腺酸化動態關聯分析網絡內部基因和任何其他基因的mRNA表達的平均皮爾森相關系數絕對值顯著下降。

4.根據權利要求1所述的一種奶牛乳腺酸化代謝調控分析的方法，在所述S6中，對于某個節點的度定義為與之相鄰的節點數，節點的平均度是所有節點的度的平均值，根據差異共表達基因和差異共表達基因對獲得了一個N*N的二維數組A，其中N為節點數，數組A中的每個元素Aij被定義為：

節點i的度Ki是與i直接相連的節點數，表示為：

因而，節點的平均度可定義為：

對于每個節點，其聚類系數以直連節點的比例計算，并計算網絡中聚類系數的平均值，具體為，節點i的聚類系數Ci是由網絡中的兩個節點在有共同鄰居i的情況下相鄰的概率來度量的，并根據設計的二維數組A計算，如下：

網絡的平均聚類系數C可表示為；