[發明專利]一種微流控芯片及其在腫瘤干細胞分選、富集中的應用

在審

• 申請號: 202110650829.6
• 申請日: 2021-06-10
• 公開（公告）號: CN113564045A
• 公開（公告）日: 2021-10-29
• 發明（設計）人: 劉大漁;林冬果
• 申請（專利權）人: 廣州市第一人民醫院（廣州消化疾病中心;廣州醫科大學附屬市一人民醫院;華南理工大學附屬第二醫院）
• 主分類號: C12M3/00
• 分類號: C12M3/00;C12M1/00
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 顏希文

本發明屬于生物醫學及腫瘤細胞研究領域，具體涉及一種微流控芯片及其在腫瘤干細胞分選、富集中的應用。其中，微流控芯片包括底層和頂層，底層上鋪設有液滴發生器，液滴發生器上設有油相注入孔、水相注入孔以及液滴池；頂層開設有與油相注入孔相連通的油相分配通道、與水相注入孔相連通的水相分配通道、以及與液滴池相連通的排液通道；本發明利用微流控芯片中的液滴發生器將腫瘤細胞懸液分散成單細胞液滴，利用干細胞培養基對單細胞液滴中的腫瘤細胞進行培養分選、富集，無需標記即可實現腫瘤干細胞的分選、富集，使得本發明微流控芯片具有良好的普適性。

技術領域

本發明屬于生物醫學及腫瘤細胞研究領域，具體涉及一種微流控芯片及其在腫瘤干細胞分選、富集中的應用。

背景技術

腫瘤干細胞是腫瘤群體中極少量異質性特征突出，但是能夠決定腫瘤特性和命運的細胞。腫瘤干細胞的特性包括：無限的體內和體外增殖能力、定向分化能力以及對于理化傷害的強耐受能力。大量研究結果證實腫瘤干細胞不僅是引起腫瘤的原因，也是造成腫瘤轉移、復發和治療耐受的直接原因。因此，針對腫瘤干細胞的治療有望根治腫瘤。由于個體差異、腫瘤類型差異以及腫瘤細胞信號通路差異，腫瘤干細胞的性質會有所不同，因而腫瘤干細胞的靶向治療策略也會有所不同，因此，基于腫瘤干細胞的分子機制研究和藥物測試是腫瘤干細胞靶向治療必不可少的環節。

由于腫瘤干細胞數量稀少，因而腫瘤干細胞的分子機制研究和藥物測試依賴于腫瘤干細胞分選和富集。近年來發展了一系列的腫瘤干細胞分離/富集技術，如流式細胞分析技術，主要是基腫瘤干細胞表面分子標志物進行分離，其原理是腫瘤干細胞具有特殊的表面標志物，例如乳腺癌干細胞表面標志物為Lin-CD44+/CD24-；腦膠質細胞瘤干細胞表面標志物為CD133+；結腸癌干細胞表面標志物為CD133+、CD44+、CD166+、EpCAM+；胰腺癌干細胞表面標志物為CD44+、CD24+、ESA+等。然而，由于細胞表面標志物的表達存在異質性和可塑性，這類方法存在可靠性和普適性欠佳的問題。此外，流式細胞分析對細胞本身的化學和生物性質有一定的影響，不利于后續的分析。

基于上述流式細胞儀存在的可靠性和普適性欠佳的問題，通過依賴腫瘤干細胞的自我更新能力進行富集，有助于克服上述普適性欠佳的問題，但如何從腫瘤細胞中將腫瘤干細胞進行分選，限制了依賴腫瘤干細胞自我更新能力進行富集這一方法的應用。

目前，傳統的體外單細胞試驗需要利用有限稀釋法進行細胞分散，這種細胞分散方法所能提供的單個細胞獲取效率和分析通量存在明顯的限制，遠遠不能滿足腫瘤干細胞富集的需求，并且，該種方法無法排除細胞間的接觸和信息交流，細胞聚集體的形成并不能有效反映腫瘤干細胞的數量，因此，為實現高效的腫瘤干細胞富集，迫切需要一種可完成高通量單細胞克隆形成試驗的技術平臺。

發明內容

針對現有腫瘤干細胞分選和富集方法存在的數量有限、可靠性以及普適性欠佳的問題，本申請旨在提供一種具有良好普適性的微流控芯片，并基于該微流控芯片提供一種腫瘤干細胞分選、富集的方法，具有良好的普適性，并能有效保持腫瘤干細胞的干性以及提高富集后腫瘤干細胞的數量。

基于上述目的，本發明采用的技術方案如下：

第一方面，本發明提供一種微流控芯片，包括底層和頂層，底層上鋪設有液滴發生器，液滴發生器上設有油相注入孔、水相注入孔以及液滴池；頂層開設有與油相注入孔相連通的油相分配通道、與水相注入孔相連通的水相分配通道、以及與液滴池相連通的排液通道。

前期研究發現，腫瘤細胞群體中有少量細胞具有克隆形成能力，基于該發現，發明人所在研究團隊通過控制腫瘤細胞的培養條件，對腫瘤細胞進行成球試驗，成功地分選出具有單細胞克隆形成能力的腫瘤干細胞，并將這部分具有自我更新能力進行富集，實現腫瘤干細胞擴增并維持腫瘤干細胞的多向分化潛能，因此，本申請在腫瘤細胞成球試驗的基礎上，設計出一種微流控芯片。