[發明專利]基于SNaPshot分型方法的NGS測序樣本標記與追蹤檢測方法

有效

• 申請號: 202110649808.2
• 申請日: 2021-06-10
• 公開（公告）號: CN113718022B
• 公開（公告）日: 2023-06-02
• 發明（設計）人: 孫遠志
• 申請（專利權）人: 武漢天一華煜基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6858
• 代理公司: 成都頂峰專利事務所(普通合伙) 51224
• 代理人: 李林

本發明公開了一種基于SNaPshot分型方法的NGS測序樣本標記與追蹤檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：標記位點篩選：基于NGS測序PANEL基因列表，初步篩選出MAF0.3的SNP位點；通過SNaPshot多重引物設計和實驗檢測穩定性篩選出20個位點；分別設計出20個位點的引物并合成；利用上述合成的引物與樣本DNA提取液依次發生PCR反應、第一次SAP純化反應、單堿基延伸反應、第二次SAP純化反應、測序以及收集數據；本發明通過SNaPshot多重引物設計篩選出20個位點和根據這20個位點設計合適的引物，實現了單個反應能夠檢測20個位點，提升檢測效率和降低檢測成本。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種基于SNaPshot分型方法的NGS測序樣本標記與追蹤檢測方法。

背景技術

隨著精準醫學項目在全世界范圍內的不斷開展，基于新一代測序(NGS)技術的大規模基因組數據采集已經成為重要的研究手段之一。在此基礎上建立起來的大數據平臺，輔以精準、全面的健康和醫學數據，將為疾病的診斷與治療，藥物的研發與個體用藥，人群的健康保障等臨床與轉化醫學研究帶來極大的推動。

在大規模人群中開展NGS測序工作時，樣本的準確性、可溯源性將會對最終的大數據質量產生不可忽視的影響。由于NGS測序流程的復雜性，在樣本庫內得到準確標記的樣本，在測序流程中仍然有一定幾率會發生混淆或者污染。根據國際上大型測序中心的估算，隨著測序樣本量的增加，一個操作流程完善、工作人員受過專業培訓的基因檢測實驗室，仍然有可能產生千分之一左右的樣本偏差，因此，一種準確有效卻又成本低廉的樣本標記與追蹤手段，在大規模NGS測序工作中具有重要的現實意義。

在美國ACMG(美國醫學遺傳學與基因組學學院)發布的“臨床實驗室NGS測序標準”中指明：“相關實驗室必須采取措施，避免樣本混淆，并能夠隨時追蹤與確認終結果”。2017年3月，中華醫學會病理學分會發布的“臨床分子病理實驗室二代基因測序檢測專家共識”中進一步闡明：“為確保檢測過程中樣本沒有混淆或污染，可選用多個SNP位點或其他標簽作為樣本身份標識(sample?ID)，在檢測前對每個樣本進行SNP位點信息的測定，在NGS檢測后對上述位點進行追蹤，證明沒有交叉污染”。

發明內容

針對現有NGS測序流程的復雜性，在樣本庫內得到準確標記的樣本，在測序流程中仍然有一定幾率會發生混淆或者污染的問題，本發明提供一種基于SNaPshot分型方法的NGS測序樣本標記與追蹤檢測方法。

為了解決上述問題，本發明采用以下技術方案：一種基于SNaPshot分型方法的NGS測序樣本標記與追蹤檢測方法，包括以下步驟：

標記位點篩選：基于NGS測序PANEL基因列表，初步篩選出MAF0.3的SNP位點；通過SNaPshot多重引物設計篩選出20個位點；

分別設計出20個位點的引物并合成；

利用上述合成的引物與樣本DNA提取液依次發生PCR反應、第一次SAP純化反應、單堿基延伸反應、第二次SAP純化反應、測序以及收集數據。

進一步限定，所述20個位點的上游引物的核苷酸序列分別如SEQ?ID?N0.1-20所示，所述20個位點的下游引物的核苷酸序列分別如SEQ?ID?N0.21-40所示。

進一步限定，所述20個位點的單堿基延伸引物的核苷酸序列如SEQ?ID?N0.41-60所示。

進一步限定，所述PCR反應包括以下步驟：

配制PCR混合液且離心；混合PCR混合液和樣本DNA提取液的DNA得到混合物；將混合物按照如下程序進行反應：預變性、94℃、5min；變性94℃、20sec，退火60℃、30sec，延伸72℃、30sec，變性、退火以及延伸組成的過程循環35次；最后延伸72℃，3min；保存溫度4℃。