[發(fā)明專利]一種快速鑒別老年黃斑病變風險的方法及應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2021-07-23
• 公開（公告）號: CN113293206A
• 公開（公告）日: 2021-08-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李鵬;齊琳潔;張曉飛;程芳婷;梁亮;李默
• 申請（專利權(quán)）人: 西安醫(yī)臻生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 西安銘澤知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 61223
• 代理人: 崔瑞迎

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種快速鑒別老年黃斑病變風險的方法，通過樣本DNA提取，ARMS?qPCR法擴增樣本DNA，通過設(shè)置A、B兩組擴增組在同一臺儀器上同時進行擴增檢測。本發(fā)明中通過設(shè)置兩組擴增組在同一臺儀器上同時擴增檢測，能夠快速準確的鑒別風險人群，大大提高了檢測基因的特異性，低污染，檢測時間短。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速鑒別老年黃斑病變風險的方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)是眼科常見的神經(jīng)退行性疾病,也是歐美等發(fā)達國家老年人群致盲的主要原因。據(jù)統(tǒng)計,發(fā)達國家AMD發(fā)病人數(shù)將達300萬,50歲以上人群眼病患病率中,AMD占3.5％。當前,AMD已成為世界公共衛(wèi)生組織重點關(guān)注的疾病。AMD發(fā)病過程主要是光感受器、視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigmentepithelial,RPE)細胞及血液供應(yīng)改變,造成視神經(jīng)退行性萎縮,病情進展至末期形成中心視力不可逆性喪失。AMD發(fā)病機制尚未明確,年齡、飲食、環(huán)境、遺傳以及種族等因素與發(fā)病過程密切相關(guān)。目前老年性黃斑病變的常規(guī)檢測手段只能在黃斑病變有明顯癥狀后作出診斷，可能會延誤最佳治療時機。

基因多態(tài)性檢測是指以含有遺傳信息的物質(zhì)(如血液)為起始材料，通過核酸提取、擴增和對擴增產(chǎn)物進行表征等過程檢測基因序列的差異，目前報道的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)檢測方法主要有：直接測序法、高分辨率熔解曲線法(HRM)、PCR-RFLP法、Taqman探針法、突變擴增系統(tǒng)(amplification refractorymutation system,ARMS)PCR法等。直接測序法雖是SNP分析的金標準，可發(fā)現(xiàn)已知和未知的SNP位點，但每個位點均需經(jīng)PCR擴增，然后測序，成本較高，工作量大，周期長、不適合大樣本做疾病關(guān)聯(lián)分析，且易發(fā)生交叉污染。Taqman探針法適合少量位點大量樣本的分型項目，但其探針合成價格昂貴，不適合少量樣本多位點分型，特別是頻率偏低的位點。PCR-RFLP法優(yōu)點是分型技術(shù)簡單，結(jié)果判定容易，避免測量誤差，結(jié)果穩(wěn)；其缺點是序列多態(tài)性座位中大約只有1/3的堿基涉及限制酶識別序列，遺傳標記系統(tǒng)的個人識別能力有限，限制酶消化條件較高。HRM法可高通量檢測基因的突變情況，但其所需檢測儀器比普通的熒光PCR儀更為精密，對溫度敏感性要求高，受儀器影響大很難普及。ARMS-PCR法，又稱等位基因特異性擴增法，其基本原理是因為Taq DNA聚合酶缺少3’-5’外切酶活性，如果引物的3’端堿基與模板堿基不互補，則用一般耐熱DNA聚合酶無法延伸。因此根據(jù)已知點突變設(shè)計3條引物，其3’端堿基分別與突變和正常的模板堿基互補，從而將有某種點突變的模板與正常模板區(qū)分開來。ARMS-PCR可檢測DNA分子上任何點突變和小的缺失，其方法可靠、不依賴于任何特殊標記，但往往反應(yīng)結(jié)束后還需進行凝膠電泳，增加了PCR污染的機會，且耗時費力。因此，迫切需要開發(fā)一直高靈敏度，經(jīng)濟實惠、快速且結(jié)果判讀準確可靠的檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種快速鑒別老年黃斑病變風險的方法，能夠快速準確的鑒別風險人群，大大提高了檢測基因的特異性，低污染，檢測時間短。

本發(fā)明提供了一種快速鑒別老年黃斑病變風險的方法，具體包括如下步驟：

S1，樣本DNA提取；

S2，ARMS-qPCR法擴增樣本DNA：

以S1中提取的樣本DNA為模板，設(shè)置野生型引物擴增組，記為A組，設(shè)置突變型引物擴增組，記為B組，A組和B組的正向引物均為CFH-F，其核苷酸序列如如SEQ ID NO.1所示；

A組反向引物記為CFH-R(T)，其序列如SEQ ID NO.2所示；

B組的反向引物記為CFH-R(C)，其序列如SEQ ID NO.3所示；