[發明專利]檢測線粒體膜電勢的可遺傳熒光探針及其應用

有效

• 申請號: 202110649309.3
• 申請日: 2021-06-08
• 公開（公告）號: CN113234719B
• 公開（公告）日: 2022-04-29
• 發明（設計）人: 黃增益;張子元;王虹;任肅霞;程志;劉德一;徐超英;譚欣;譚力
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/85;C12N5/10;G01N21/64;G01N1/02
• 代理公司: 重慶航圖知識產權代理事務所(普通合伙) 50247
• 代理人: 王貴君

本發明公開了一種檢測線粒體膜電勢的可遺傳熒光探針及其應用，該熒光探針是由PINK1基因截短片段和熒光蛋白基因融合所得，最為優選的PINK1基因截短片段為SEQ IDNO.1所示的野生型PINK1基因序列的1?390bp。本發明所提供的熒光探針具有制備方法簡單，易儲存，生物毒性低等優點；基于可遺傳的特點，該線粒體膜電勢探針應用面廣泛，結合現代成像技術，可以快速靈敏的對目標細胞、組織、器官甚至是生命體的線粒體膜電勢進行準確測量。

技術領域

本發明屬于細胞生物學領域,具體涉及一種檢測線粒體膜電勢的可遺傳熒光探針及其應用。

背景技術

線粒體通過氧化呼吸鏈來合成ATP。在氧化呼吸鏈中，電子由NADH，FADH2遞氫體傳遞到呼吸鏈復合物，同時將質子主動運輸到內膜外。內膜內外質子濃度梯度和跨膜電位差所儲存的電化學勢能即為線粒體膜電勢，發揮著促使質子返回線粒體內膜，推動ATP合成酶合成ATP的作用。

線粒體膜電勢的維持是健康線粒體發揮正常功能從而維護細胞穩態的必要條件。膜電勢的異常不僅會阻礙氧化磷酸化的正常進行，還可以激活線粒體自噬通路來消除功能異常的線粒體。在多種疾病和病理情況下均檢測到細胞中線粒體膜電勢的異常，因此對線粒體膜電勢變化的檢測有助于我們加深對于疾病發展的進一步理解，有著重要的科學意義和現實意義。

對于線粒體膜電勢的檢測主要有電化學方法和熒光成像等方法。電化學方法主要是利用微電極準確測量線粒體內膜內外的電勢差，具有很好的準確性。但由于線粒體體積小，難以精準的嵌入微電極，限制了電化學方法進行。熒光成像方法的主要原理是在細胞中線粒體膜電勢發生改變后，其熒光染料在細胞中的熒光性質會發生一定的改變，從而根據熒光信號的改變來間接反映線粒體的膜電勢。熒光染料對于線粒體膜電勢的測量具有簡單、方便、對細胞損傷較小等優點，因而被廣泛應用于科學研究當中。目前，JC-1是常用于檢測線粒體膜電勢的熒光探針。正常線粒體膜電勢情況下，JC-1在線粒體中呈現聚集態，發出橘紅色的熒光，而在低線粒體膜電勢的情況下，JC-1在線粒體中呈現單體態，發出綠色熒光，因此JC-1可通過熒光顏色的變化反映線粒體膜電勢的變化。然而，作為可跨越線粒體膜的染料，外源添加JC-1等熒光染料對于線粒體具有潛在的影響。同時，目前的檢測線粒體膜電勢熒光成像方法不具有可遺傳性，難以對疾病的全程，整體進行觀測。因此，開發一種可遺傳檢測線粒體膜電勢熒光探針是非常必要的。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種檢測線粒體膜電勢的可遺傳熒光探針；本發明的目的之二在于提供含有所述熒光探針的重組質粒；本發明的目的之三在于提供含有所述重組質粒的轉化體；本發明的目的之四在于提供所述熒光探針檢測線粒體膜電勢的方法；本發明的目的之五在于提供所述熒光探針在檢測線粒體膜電勢降低中的應用；本發明的目的之六在于提供所述熒光探針在標記線粒體在活細胞中的分布中的應用。

為達到上述目的，本發明提供如下技術方案：

1、一種檢測線粒體膜電勢的可遺傳熒光探針，所述熒光探針是由PINK1基因截短片段和熒光蛋白基因融合所得，所述PINK1基因截短片段為SEQ ID NO.1所示的野生型PINK1基因序列的1-390bp或1-240bp。

本發明中優選的，所述PINK1基因截短片段為SEQ ID NO.1所示的野生型PINK1基因序列的1-390bp。

本發明中優選的，所述熒光蛋白基因為紅色熒光蛋白基因。

本發明中更為優選的，所述紅色熒光蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2、含有所述熒光探針的重組質粒。

本發明中優選的，所述重組質粒為將所述的熒光探針的核苷酸序列插入到pCMV載體或pcDNA載體的多克隆位點處。

3、含有所述重組質粒的轉化體。