[發明專利]一種綿羊骨骼肌衛星細胞的高效分離和純化方法

在審

• 申請號: 202110647603.0
• 申請日: 2021-06-10
• 公開（公告）號: CN113337460A
• 公開（公告）日: 2021-09-03
• 發明（設計）人: 烏日罕;馮青輝;格日勒圖;付艷茹
• 申請（專利權）人: 呼和浩特職業學院
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 西安合創非凡知識產權代理事務所(普通合伙) 61248
• 代理人: 張翠華

本發明公開了一種綿羊骨骼肌衛星細胞的高效分離和純化方法，包括如下步驟：75%酒精浸泡肌肉組織15min后，切取所需骨骼肌，用含有1%雙抗的PBS清洗，去除結締組織，剪碎至2mm³移入離心管后PBS反復吹打3次，自然沉降，棄上清液,將組織塊移入培養瓶中,吸去多余液體,每25cm²生長面加入1ml培養基，緩慢傾斜培養瓶至組織塊均勻分布于生長面，蓋瓶蓋后37℃，5%CO₂，飽和濕度培養8?24h，然后加入1ml培養基，連續每隔24h加入1ml培養基，直至培養基體積為5ml/25cm²，每周換液一次，直至細胞生長趨于穩定。本發明的方法成本低且對細胞損傷極小，因此可以收集更多的細胞。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種綿羊骨骼肌衛星細胞的高效分離和純化方法。

背景技術

骨骼肌衛星細胞（SMSCs）是一種成體干細胞，它也是與骨骼肌生長和修復相關的肌原性的前體細胞，其位于肌纖維的基膜和基底膜之間。由于其獨特的存在位置，骨骼肌衛星細胞的分離過程不同于其他細胞如肌纖維細胞的分離及純化，相較于其他細胞的分離，骨骼肌衛星細胞的分離方法更復雜，更加困難。再者，SMSCs分離過程中通常摻雜著其他細胞，比如成纖維細胞、內皮細胞和其它血管相關的細胞等等，因此如果要得到純度較高的骨骼肌衛星細胞，必須結合科學合理的純化方法。在細胞的分離實驗中，常用的方法有兩種，一種是原代外植塊培養法（Primary explants culture）；另一種是兩步酶消化法（Twosteps enzyme gradation digestion）。

在原代外植塊培養（也叫組織塊培養）中，在培養基質中各類細胞的貼附順序不同。一些前體細胞主要在早期貼附，培養后期貼附的細胞則具有一定原始細胞的特征，例如骨骼肌衛星細胞。有研究已經證實后期貼附細胞有著不典型的增殖模式和多能分化特性。因此可以通過控制細胞貼附所需時間的先后順序來純化骨骼肌衛星細胞。對于SMSCs的培養，多項研究采用了分步酶消化法，其中所選用的酶主要有膠原酶、透明質酸酶、胰蛋白酶和鏈激酶等等。然后結合差速貼壁法進行純化，其原因是由于成纖維細胞在體外培養中有較強的增殖活力和增殖速度，而且其形態特征不易與肌細胞區別，因此純化以去除混雜的成纖維細胞。差速貼壁法原理為，當細胞接種數小時后，成纖維細胞先貼壁，此時可以將細胞懸液回收并進行第2次接種，從而可以獲得純度較高的SMSCs。當在倒置相差顯微鏡下看到大量的紡錘形單核細胞出現，此細胞即為開始貼壁的骨骼肌衛星細胞。因為多步酶消化法可能清除骨骼肌衛星細胞的表面抗原，從而使得細胞的完整性受到破壞，再導致細胞功能的紊亂，而且大多是細胞在經過多次酶的處理后容易被消化，從而引起大量細胞的損失，因此相關研究曾嘗試用組織塊培養法來克服這些困難。SMSCs的分離培養也可以采用組織塊培養法。但，隨著培養時間的延長，衛星細胞匯合度增加并逐漸相互融合，從而形成多核的肌管，最終形成具有方向性的成束骨骼肌細胞。

由于細胞的生長過程包括增殖期、停滯期以及分化期，因此曾有研究利用細胞的這一生長特性，先用增殖培養基（配方為：F10 + 10% FCS）使細胞處于增殖期以收集足夠的數量。在衛星細胞的培養過程中，其培養基的配方決定著細胞生長的方向，具體講，主要決定細胞培養方向的是培養基中的血清濃度：當培養基中血清濃度較高時（比如，FBS濃度達10%-20%），SMSCs以分裂增殖為主; 而當血清濃度較低時（比如，FBS濃度為1%-5%），SMSCs則以分化為主。另外，培養環境對SMSCs的生長也有一定影響，其中氧氣濃度對細胞生長影響最大，通常，低氧條件有利于細胞增殖。有研究將SMSCs經膠原酶消化后置于低氧狀態（2%O2，37 ℃）中進行培養，當細胞培養至開始融合，進一步改用分化培養基（DM），其配方為DMEM+2%FBS+1% 雙抗+1% 胰島素-轉鐵因子-硒補充劑+0.4mg /mL地塞米松，實驗結果證明此培養條件可以促進SMSCs的分化。