[發明專利]一種基于2,4,6-三氨基嘧啶調控的類石墨相氮化碳的電化學免疫傳感器的制備方法

在審

• 申請號: 202110646712.0
• 申請日: 2021-06-10
• 公開（公告）號: CN113281389A
• 公開（公告）日: 2021-08-20
• 發明（設計）人: 胡麗華;師騰飛;崔倩倩;宋翠;張勇;馬洪敏;吳丹;范大偉;魏琴
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: G01N27/26
• 分類號: G01N27/26;G01N27/30;G01N27/327
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種基于2,4,6-三氨基嘧啶調控的類石墨相氮化碳的電化學免疫傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）2,4,6-三氨基嘧啶調控的類石墨相氮化碳的制備

用三聚氰胺和2,4,6-三氨基嘧啶共聚制備了2,4,6-三氨基嘧啶調控的類石墨相氮化碳，將1 g 三聚氰胺和10 ~ 50 mg的2,4,6-三氨基嘧啶充分均勻地混合在瑪瑙研缽中進行研磨，然后將混合物置于帶蓋的坩堝中，在馬弗爐中以5 ℃ min^-1升溫速率升至550 ℃保持加熱4 h，得到2,4,6-三氨基嘧啶調控的類石墨相氮化碳，不添加2,4,6-三氨基嘧啶時，其他條件都相同，制備了原始的類石墨相氮化碳；

（2）2,4,6-三氨基嘧啶調控的類石墨相氮化碳結合神經元特異性烯醇化酶識別抗體的一抗標記物的制備

將5 ~ 20 μg mL^-1的神經元特異性烯醇化酶的一抗在4 ℃下使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）進行活化，然后與2,4,6-三氨基嘧啶調控的類石墨相氮化碳在4 ℃下共同孵化6 h，得到2,4,6-三氨基嘧啶調控的類石墨相氮化碳結合神經元特異性烯醇化酶識別抗體的一抗標記物；

（3）Fe-ZIF的制備

先將1 ~ 3 g的2-甲基咪唑溶于30 mL無水甲醇中，記為溶液A；此外將0.1 ~ 0.5 g七水合硫酸亞鐵和0.6 ~ 1 g六水合硝酸鋅混合溶于30 mL無水甲醇，記為溶液B；將兩種溶液混合攪拌均勻，并在35 ℃下不斷攪拌反應4 h，將反應完成的混合溶液離心，收集所得產物，并用無水甲醇洗滌離心3次，將洗滌后的產物于60 ℃真空干燥箱中烘干過夜，得到Fe-ZIF粉末；

（4）硫化銅量子點的制備

將20 ~ 50 mg九水合硫酸鈉溶于3 mL去離子水中得到硫化鈉溶液備用，將50 ~ 100mg氯化銅與80 ~ 100 mg檸檬酸三鈉溶于300 mL超純水中，磁攪拌得到淺藍色透明溶液，將充分溶解的溶液進行加熱，于90 ℃下反應30 min，在加熱過程中緩慢滴加上述硫化鈉溶液，在這過程中可以觀察到溶液逐漸變為墨綠色，且有沉淀生成，將反應完成后的懸浮液離心，收集所得產物，并用超純水洗滌離心3次，將洗滌過后的硫化銅量子點懸浮液溶于5 mL去離子水中在4 ℃下保存備用；

（5）Fe-ZIF負載硫化銅量子點復合材料的制備

將制得的50 ~ 100 mg的 Fe-ZIF粉末溶于300 mL去離子水中，磁攪拌使其充分分散，然后緩慢滴加上述硫化銅量子點懸浮液，使Fe-ZIF對硫化銅量子點進行充分負載，攪拌8 h后將混合溶液進行離心，收集所得產物，并用去離子水洗滌離心3次，將洗滌過后的產物于60 ℃真空干燥箱中烘干過夜，即得到Fe-ZIF負載硫化銅量子點復合材料；

（6）PBS緩沖溶液的配置

取11.94 g十二水合磷酸氫二鈉定容于500 mL的容量瓶中配置成濃度為1/15 mol L^-1的水溶液，作為甲液；取4.54 g磷酸二氫鉀定容于500 mL的容量瓶中配置成濃度為1/15mol L^-1的水溶液，作為乙液；將甲液和乙液按比例混合，配置成一系列pH在6.0 ~ 8.0的PBS緩沖溶液；

（7）Fe-ZIF負載硫化銅量子點并結合神經元特異性烯醇化酶識別抗體的二抗標記物的制備

將20 ~ 100 μL 神經元特異性烯醇化酶二抗（10 μg mL^-1）加入到1 mL 1 ~ 3 mg mL^-1Fe-ZIF負載硫化銅量子點復合材料水溶液中，并在4 ℃下震蕩孵化12 h，離心后將得到的產物分散在1 mL PBS中，即得Fe-ZIF負載硫化銅量子點并結合神經元特異性烯醇化酶識別抗體的二抗標記物溶液；

（8）電化學免疫傳感器的制備

1）用三氧化二鋁拋光粉打磨直徑為4 mm的玻碳電極，超純水清洗干凈，將6 μL、0.5 ~2.5 mg mL^-1的2,4,6-三氨基嘧啶調控的類石墨相氮化碳結合神經元特異性烯醇化酶識別抗體的一抗標記物溶液滴加到電極表面，室溫下晾干；

2）繼續滴加3 μL、質量分數為0.1%的牛血清蛋白溶液到電極表面，用超純水洗凈，室溫下晾干；

3）繼續滴加6 μL、0.00005 ~ 100 ng mL^-1的一系列不同濃度的神經元特異性烯醇化酶抗原到電極表面，孵化2 h，超純水沖洗，室溫下晾干；

4）最后滴加6 μL的Fe-ZIF負載硫化銅量子點并結合神經元特異性烯醇化酶識別抗體的二抗標記物溶液，超純水沖洗，室溫下晾干，制得一種檢測神經元特異性烯醇化酶的電化學免疫傳感器。