[發明專利]一種用于檢測犬乙型腦炎病毒抗體的膠體金試紙條及其制備方法

在審

• 申請號: 202110643141.5
• 申請日: 2021-06-09
• 公開（公告）號: CN113640514A
• 公開（公告）日: 2021-11-12
• 發明（設計）人: 鐘登科;鄭江平;滑志民;王金福;戰曉燕;尚月麗;向必吉;向亮;魏建芳
• 申請（專利權）人: 上海農林職業技術學院;上海諾龍生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/558;G01N33/543;G01N33/52;C07K14/18;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22
• 代理公司: 臺州浙粵壟專利代理事務所(普通合伙) 33419
• 代理人: 王洪臣

1.一種用于檢測犬乙型腦炎病毒抗體的膠體金試紙條，其包括底襯卡，底襯卡之上從前到后依次粘貼樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中硝酸纖維素膜粘貼在底襯卡上，其上分布有重組犬乙型腦炎病毒EDⅢ抗原包被形成的檢測帶和羊抗兔IgG包被形成的質控帶；所述的結合墊處于硝酸纖維素膜的前端，由膠體金顆粒噴涂于玻璃纖維膜上干燥制備得到；所述的樣品墊處于結合墊的前端，用于點樣；所述的吸水墊位于硝酸纖維素膜的后端，用于吸收樣品中多余的水。

2.一種用于檢測犬乙型腦炎病毒抗體的膠體金試紙條的制備方法，其包括如下步驟:

1)重組犬乙型腦炎病毒EDⅢ抗原的制備：將重組工程菌株接種到LB培養基中，37℃培養至吸光度A₆₀₀＝0.6時，向其中加入IPTG誘導培養，收集菌體并進行SDS-PAGE測定純度，得重組犬乙型腦炎病毒EDⅢ抗原粗品；

2)重組犬乙型腦炎病毒EDⅢ抗原的純化：將收集菌體超聲裂解后溶于8mol/L尿素，離心收集上清液；使用Ni²⁺-NTA金屬螯合蛋白質純化柱純化包含重組犬乙型腦炎病毒EDⅢ抗原的上清液，洗脫同時取20μL洗脫液樣本進行SDS-PAGE凝膠電泳檢測，收集目標洗脫液，得純化后的重組犬乙型腦炎病毒EDⅢ抗原；

3)重組犬乙型腦炎病毒EDⅢ抗原的復性：將純化后的重組犬乙型腦炎病毒EDⅢ抗原轉入透析袋放入4℃透析液中，通過更換透析液透析至尿素濃度降至0.2mol/L；然后使用PBS緩沖液透析3次，3h/次；使用PEG 20000濃縮蛋白質，高速離心后收集上清液，NanoDrop定量測定濃度后置于-80℃保存備用；

4)重組犬乙型腦炎病毒EDⅢ抗原免疫層析試紙條的制備：制備膠體金結合墊；將重組犬乙型腦炎病毒EDⅢ抗原和羊抗兔IgG分別稀釋至1mg/ml和1.2mg/ml，包被于硝酸纖維素膜上作為檢測帶和質控帶，置于37℃干燥2h；將樣品墊、結合墊、吸水墊依次貼在底襯卡上，切成寬度為0.4cm的條，裝殼即得用于檢測犬乙型腦炎病毒抗體的膠體金試紙條。

3.根據權利要求1所述的用于檢測犬乙型腦炎病毒抗體的膠體金試紙條的制備方法，其特征在于，所述步驟1)中IPTG的終濃度為1mmol/L，誘導培養時間為6小時。

4.根據權利要求1所述的用于檢測犬乙型腦炎病毒抗體的膠體金試紙條的制備方法，其特征在于，步驟4)中結合墊的制備方法包括如下步驟：采用檸檬酸鈉還原法制備25nm的膠體金；將制備好的膠體金以0.1mol/L K₂CO₃調節pH至6.6～7.0后，按照1mL膠體金標記4μg葡萄球菌A蛋白，將其噴涂于玻璃纖維膜上，37℃干燥2h制備得到結合墊。

5.一種應用膠體金試紙條檢測犬乙型腦炎病毒抗體的方法，其特征在于，其包括如下步驟：將血清樣品稀釋液和待檢血清混勻，取100μL混合液滴加在樣品墊上，20min左右依據判斷標準對檢測結果進行判斷。

6.一種應用膠體金試紙條檢測犬乙型腦炎病毒抗體的方法，其特征在于，所述的判斷標準為：僅質控帶出現紅色，則結果為陰性；若質控帶和檢測帶均出現紅色，則結果為陽性；若質控帶和檢測帶沒有顯色或者只有檢測帶顯色，則試紙條已經失效，結果無效。

7.權利要求1所述的膠體金試紙條在檢測犬乙型腦炎病毒抗體中的應用。