[發明專利]一種含有肉牛DKK3基因3’UTR序列和雙熒光素酶報告基因的質粒及其應用

有效

• 申請號: 202110633266.X
• 申請日: 2021-06-07
• 公開（公告）號: CN113322278B
• 公開（公告）日: 2022-07-15
• 發明（設計）人: 張鳳;陳明新;熊琪;劉洋;張年;陶虎;李曉鋒;索效軍;楊前平;張鶴山;田宏;熊軍波;陸姣云
• 申請（專利權）人: 湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/65;C12N15/66;C12N15/12;C12Q1/66
• 代理公司: 武漢智嘉聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 42231
• 代理人: 丁倩

本發明提供了一種含有肉牛DKK3基因3’UTR序列和雙熒光素酶報告基因的質粒及其應用，所述質粒包含bta?miR?25與牛DKK3結合的靶點，其構建包括設計DKK3基因3’UTR區擴增引物并加入酶切位點Pme I和Xho I，以牛腎細胞(MDBK)cDNA為模板進行擴增，將PCR產物及pmirGLO Vector分別用限制性內切酶Pme I和Xho I進行雙酶切，將酶切后純化的載體pmirGLO Vector和DKK3基因3’UTR片段連接，轉化，培養，PCR檢測，測序，將測序正確的菌液重新擴大培養，質粒提取等步驟，本發明為篩選調控DKK3表達的miRNAs、評估miRNAs對DKK3表達的調控作用提供了簡單易行的工具，具有靈敏度高、速度快和費用低等優點；本發明還為DKK3的表達調控帶來了更深層次的認知，能運用于家畜肉質遺傳改良分子調控機制的研究，具有較好的應用前景。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，具體涉及一種含有肉牛DKK3基因3’UTR序列和雙熒光素酶報告基因的質粒及其應用。

背景技術

DKK3(Dickkopf-3)是一種分泌蛋白，通過調節Wnt信號轉導途徑發揮作用，是Wnt/β-catenin信號通路的抑制劑。目前關于DKK3的研究主要集中在心血管及腫瘤細胞增殖與侵襲領域，在家畜肉質及脂肪沉積方面的研究還未見報道。Wnt信號通路主要有3個分支：Wnt/β-catenin通路、Wnt/Ca²⁺通路和Wnt/polarity通路，其中Wnt/β-catenin通路是經典的Wnt信號通路，對脂肪細胞分化起到了關鍵的負調控作用。據此，我們推測DKK3極可能參與調控家畜的脂肪生成。

MicroRNAs(miRNAs)是一類內源性的長度約為22nt的單鏈非編碼RNA小分子，不同的miRNAs在生物系統中的功能是確定的，它們通常結合到靶基因的3’UTR，降解靶基因或抑制靶基因的翻譯，從而降低靶基因的表達水平，影響基因發揮應有的功能(Bartel 2004；Carthew and Sontheimer 2009；Malan-Muller et al.,2013)。成千上萬的miRNAs已經被確認參與很多生物學過程中，比如細胞增殖、分化、發育和新陳代謝等(Ning et al.,2014)，故而miRNA對靶基因的調控研究是非常值得關注的領域。

我國居民肉類消費進入轉型升級階段，牛肉的消費需求整體呈現增長加速的態勢。為了研究miRNAs對肉牛DKK3基因的調控作用，針對DKK3基因的3’UTR設計相應的篩選和檢測方法是非常有必要的，也為進一步研究DKK3基因在家畜肉質性狀方面發揮的調控作用打下了基礎。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術之缺陷，提供一種含有肉牛DKK3基因3’UTR序列和雙熒光素酶報告基因的質粒，不僅能夠篩選調控DKK3基因表達的miRNAs，也為今后進一步研究DKK3基因在家畜肉質性狀方面發揮的調控作用打下了基礎。

為實現上述目的，本發明提供了一種含有肉牛DKK3基因3’UTR序列和雙熒光素酶報告基因的質粒，其特征在于通過如下方式構建：

①獲取位于DKK3基因的3’UTR區(核苷酸序列SEQ ID NO.1)的bta-miR-25與牛DKK3結合的靶點(SEQ ID NO.2)；

②設計所述DKK3基因3’UTR區擴增引物，并加入酶切位點Pme I和Xho I；以MDBK細胞cDNA為模板進行擴增，引物序列如下所示:

DKK3-3’UTR-F：5’-gggtttaaacggagcctgtcagtggag-3’(SEQ ID NO.5)；

DKK3-3’UTR-R：5’-ccgctcgaggtttagcagccctgttct-3’(SEQ ID NO.6)；