[發(fā)明專利]一種人韌帶成纖維細(xì)胞的制備方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202110632565.1
• 申請日: 2021-06-07
• 公開（公告）號: CN113355279A
• 公開（公告）日: 2021-09-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉佳
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市中佳生物醫(yī)療科技有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;A61L27/38;A61L27/36
• 代理公司: 深圳新創(chuàng)友知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44223
• 代理人: 王震宇

1.一種人韌帶成纖維細(xì)胞的制備方法，其特征在于，包括對人胎盤蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞hDMSCs進(jìn)行分離純化以及培養(yǎng)的步驟，其中，所述培養(yǎng)的步驟包括：將加入含有bFGF生長因子或含有TGF-β1生長因子或含有bFGF與TGF-β1生長因子的人無血清間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，定向誘導(dǎo)所述人胎盤蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞hDMSCs向人韌帶成纖維細(xì)胞分化。

2.如權(quán)利要求1所述的人韌帶成纖維細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述分離純化的步驟包括：取人胎盤靠近臍帶部位胎盤小葉，剝除羊膜和底蛻膜部分，取胎盤胎兒面組織，清洗后置于培養(yǎng)皿中，加入消化液于搖床上室溫消化；收集細(xì)胞消化液經(jīng)過篩網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞懸液，離心后，去上清。

3.如權(quán)利要求2所述的人韌帶成纖維細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述消化液含0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA+0.1％Ⅱ型膠原酶，室溫消化90min。

4.如權(quán)利要求2或3所述的人韌帶成纖維細(xì)胞的制備方法，其特征在于，收集細(xì)胞消化液依次經(jīng)過100μm、70μm、40μm篩網(wǎng)過濾。

5.如權(quán)利要求1至4任一項所述的人韌帶成纖維細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述培養(yǎng)的步驟包括：將分離純化后的人胎盤蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞hDMSCs加入所述人無血清間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞。

6.如權(quán)利要求5所述的人韌帶成纖維細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述人無血清間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基還含有100U/mL的青霉素和100μg/mL的鏈霉素。

7.如權(quán)利要求5或6所述的人韌帶成纖維細(xì)胞的制備方法，其特征在于，將培養(yǎng)皿置于37℃、5％CO₂的飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每3-4天換液一次。

8.如權(quán)利要求7所述的人韌帶成纖維細(xì)胞的制備方法，其特征在于，14天后收集呈克隆生長的貼壁細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移入24孔板中培養(yǎng)，每3天換液1次，當(dāng)細(xì)胞長至80-90％時，收集細(xì)胞轉(zhuǎn)移入25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，每3天換液一次。

9.如權(quán)利要求1至8任一項所述的人韌帶成纖維細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述培養(yǎng)的步驟包括：待細(xì)胞生長至接近85％融合時傳代，接種于人無血清間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至第3-4代。

10.如權(quán)利要求1至9任一項所述的人韌帶成纖維細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述人無血清間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基所含bFGF生長因子的濃度為10ng/ml；或者，所述人無血清間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基所含TGF-β1生長因子的濃度為10ng/ml；或者所述人無血清間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基所含bFGF和TGF-β1生長因子的濃度均為10ng/ml。