[發明專利]一種實時熒光定量RT-PCR檢測BlShV的方法及其使用的試劑盒有效
| 申請號： | 202110630915.0 | 申請日： | 2021-06-07 |
| 公開（公告）號： | CN113215323B | 公開（公告）日： | 2022-08-30 |
| 發明（設計）人： | 謝麗雪;沈建國;高芳鑾;李韜;張小艷;蔡偉 | 申請（專利權）人： | 福建省農業科學院果樹研究所;福州海關技術中心 |
| 主分類號： | C12Q1/70 | 分類號： | C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11 |
| 代理公司： | 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245 | 代理人： | 閆書寧 |
| 地址： | 350000 福建省福州*** | 國省代碼： | 福建;35 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 實時 熒光 定量 rt pcr 檢測 blshv 方法 及其 使用 試劑盒 | ||
1.一種用于檢測BlShV的試劑盒，包括引物BlShV-f1、引物BlShV-r1、探針BlShV-P1、引物BlShV-f2、引物BlShV-r2和探針BlShV-P2；
引物BlShV-f1為SEQ ID NO:1所示的單鏈DNA分子；
引物BlShV-r1為SEQ ID NO:2所示的單鏈DNA分子；
探針BlShV-P1為SEQ ID NO:3所示的單鏈DNA分子；
引物BlShV-f2為SEQ ID NO:4所示的單鏈DNA分子；
引物BlShV-r2為SEQ ID NO:5所示的單鏈DNA分子；
探針BlShV-P2為SEQ ID NO:6所示的單鏈DNA分子；
所述探針BlShV-P1和探針BlShV-P2的5’末端均具有FAM熒光標記，3’末端均具有MGB修飾基團。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括隨機引物、5×RTBuffer、RNA酶抑制因子、反轉錄酶、dNTPs、2×TaqMan PCR Mix、BlShV的陽性對照樣品、不含BlShV的陰性對照樣品和RNase-free ddH2O。
3.權利要求1或2所述試劑盒的應用，為h1)-h3)中任一種：
h1)檢測或輔助檢測BlShV；
h2)檢測或輔助檢測待測樣品是否感染BlShV；
h3)檢測或輔助檢測待測病毒是否為BlShV；
所述應用用于非疾病的診斷與治療。
4.一種檢測或輔助檢測待測樣品是否感染BlShV的方法，包括如下步驟：
(a1)分別獲得待測樣品、BlShV的陽性對照樣品和不含BlShV的陰性對照樣品的cDNA；
(a2)以待測樣品的cDNA為模板，采用權利要求1或2所述試劑盒中的引物BlShV-f1、引物BlShV-r1、探針BlShV-P1、引物BlShV-f2、引物BlShV-r2和探針BlShV-P2進行二重熒光定量PCR；以BlShV的陽性對照樣品的cDNA，采用權利要求1或2所述試劑盒中的引物BlShV-f1、引物BlShV-r1、探針BlShV-P1、引物BlShV-f2、引物BlShV-r2和探針BlShV-P2進行二重熒光定量PCR，作為陽性對照；以不含BlShV的陰性對照樣品的cDNA采用權利要求1或2所述試劑盒中的引物BlShV-f1、引物BlShV-r1、探針BlShV-P1、引物BlShV-f2、引物BlShV-r2和探針BlShV-P2進行二重熒光定量PCR，作為陰性對照；以RNase-free ddH2O為模板，采用權利要求1或2所述試劑盒中的引物BlShV-f1、引物BlShV-r1、探針BlShV-P1、引物BlShV-f2、引物BlShV-r2和探針BlShV-P2進行二重熒光定量PCR，作為空白對照；
(a3)如果在陰性對照無Ct值且無擴增曲線、陽性對照Ct值＜35且出現典型擴增曲線的條件下，待測樣品的Ct值≤35時，則所述待測樣品感染BlShV；如果陰性對照無Ct值且無擴增曲線、陽性對照Ct值＜35且出現典型擴增曲線的條件下，待測樣品的Ct值≥40時，則所述待測樣品未感染BlShV；若陰性對照無Ct值且無擴增曲線、陽性對照Ct值＜35且出現典型擴增曲線的條件下，35待測樣品的Ct值40時，需重新測試；
所述方法用于非疾病的診斷與治療。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于：
所述獲得待測樣品的cDNA的方法為：將待測樣品的總RNA 3μL、RNase-free ddH2O 7μL和濃度為100μmol/L的隨機引物1μL混合，70℃水浴10min，迅速冰浴5min；之后加入5×RTBuffer 5μL、濃度為10mmol/L的dNTPs 2μL、濃度為40U/μL RNA酶抑制因子1μL和濃度為200U/μL反轉錄酶1μL，42℃水浴60min，最后70℃水浴10min，得到待測樣品的cDNA。
6.如權利要求4所述的方法，其特征在于：進行二重熒光定量PCR的反應體系為25μL，由2μL待測樣品的cDNA或待測病毒的cDNA、濃度為10μmol/L的引物BlShV-f1 1μL、濃度為10μmol/L的引物BlShV-r1 1μL、濃度為10μmol/L的探針BlShV-P1 1μL、濃度為10μmol/L的引物BlShV-f2 1μL、濃度為10μmol/L的引物BlShV-r2 1μL、濃度為10μmol/L的探針BlShV-P21μL、2×TaqManPCR Mix 12.5μL和ddH2O 4.5μL組成。
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