[發明專利]一種表達糊精脫支酶的基因工程菌及其應用

有效

• 申請號: 202110629171.0
• 申請日: 2021-06-03
• 公開（公告）號: CN113430156B
• 公開（公告）日: 2023-04-28
• 發明（設計）人: 李兆豐;王亞梅;班宵逢;李才明;顧正彪;洪雁;程力
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N9/44;C12N15/56;C12P19/20;C12P19/16;C12P19/08;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 趙巧娜

本發明公開了一種表達糊精脫支酶的基因工程菌及其應用，屬于食品、生物技術領域。本發明成功構建了含有編碼基因的重組表達載體，從而獲得基因工程菌株，可高效表達新型的糊精脫支酶，采用本發明制備得到的糊精脫支酶熱穩定性好，酶活高，pH耐受性好，滿足淀粉糖生產過程中糖化反應對其溫度和pH的要求，在60?65℃條件下，糊精脫支酶依然具有較高的催化水解能力，可將糖化酶和糊精脫支酶一起加入進行反應，大大降低了生產工藝的難度和生產成本、減少糖化酶用量，節省糖化時間。

技術領域

本發明涉及一種表達糊精脫支酶的基因工程菌及其應用，屬于食品、生物技術領域。

背景技術

目前，淀粉脫支酶主要分為兩類：包括普魯蘭酶(EC3.2.1.41)和異淀粉酶(EC3.2.1.68)。普魯蘭酶和異淀粉酶分布較廣，與淀粉的水解密切相關。它們可以專一、高效地催化水解普魯蘭糖、支鏈淀粉中的α-1,6-糖苷鍵，因此在工業中的應用非常廣泛，但它們的底物特異性存在很大的差異，普魯蘭酶對普魯蘭和β-極限糊精有顯著水解活力，能夠高效地水解普魯蘭多糖，但是對大分子量的支鏈淀粉的水解活力較低，對分支非常密集的糖原幾乎沒有水解作用。異淀粉酶對支鏈淀粉和糖原表現出較高的水解活力，對小分子量的分支糊精水解活力較低，且不能水解普魯蘭多糖。Kainuma等比較了Pseudomonas異淀粉酶和Klebsiella普魯蘭酶對底物結構的特異性。發現Pseudomonas異淀粉酶最適底物為高分子量葡聚糖，如馬鈴薯支鏈淀粉、牡蠣糖原等；Klebsiella普魯蘭酶對于兩個麥芽三糖基或麥芽三糖基與麥芽四糖基之間由α-1,6糖苷鍵連接的分支寡糖具有明顯的水解作用，如普魯蘭、6³-O-α-麥芽三糖基-麥芽三糖、6³-O-α-麥芽三糖基-麥芽四糖等。兩種脫支酶最大的區別在于普魯蘭酶僅能以極慢的速度水解異淀粉酶的最適底物，而異淀粉酶幾乎不能水解普魯蘭酶的最適底物。

目前在傳統的麥芽糖漿生產工藝中使用的酶是α-淀粉酶和β-淀粉酶，他們無法水解生產過程中產生的糊精，因此，需將普魯蘭酶或異淀粉酶與β-淀粉酶協同水解實現底物的充分脫支，從而顯著提高麥芽糖的產率。

近年來，隨著我國淀粉糖工業迅速發展，糖化酶和脫支酶復配使用制備淀粉糖的應用非常廣泛。在全酶法生產淀粉糖的工藝中，因為受限于糖化酶對α-1,6-糖苷鍵的水解速率，反應的總轉化率往往達不到生產期待值。理論上增加糖化酶用量或降低淀粉漿濃度可以增大轉化率，但前者會增加生產的成本；后者需要增大糖化罐體積，將導致蒸發費用和染菌風險的增加，影響企業效益。因此，在糖化階段加入脫支酶可以減少糖化酶用量，增加淀粉的水解速度、節省糖化時間、增大底物濃度以節省后續蒸發費用。

淀粉糖化通常采用60-65℃的反應溫度，因此對脫支酶的穩定性和耐熱性要求較高，篩選新型高酶活且具有較好熱穩定性的脫支酶，具有重要得多應用意義。液化后的淀粉溶液粘度和分子量大幅度降低，形成不同水解程度的糊精溶液，目前與糖化酶復配的脫支酶中，使用最廣泛的是普魯蘭酶，但是該脫支酶的最適反應溫度(45℃)低于淀粉糖化溫度(60-65℃)，且普魯蘭酶與糖化酶需分開添加，于是在糖化過程中，為提高底物的利用率和增大轉化率，需要進行不同階段的變溫控制，將導致生產成本和生產難度的增加。

目前報道的很多微生物來源的脫支酶，如普魯蘭酶和異淀粉酶，存在產量低和高生產成本的問題，造成了商業應用的局限性，這兩種酶均存在生產方面的限制，一直以來是被國外壟斷的局面，故而篩選出不同底物特異性的脫支酶，提高其表達量以適應更廣泛的工業需求具有重要的意義和商業化價值。

發明內容

為了解決現有技術當中脫支酶的穩定性低、產物特異性不高的問題，本發明提供了一種基因工程菌，所述基因工程菌以大腸桿菌為表達宿主，表達了氨基酸序列如SEQ?IDNO.2所示的糊精脫支酶。

在本發明的一種實施方式中，以pET-20b(+)、pET-15b或pET-28a為表達載體。

在本發明的一種實施方式中，所述糊精脫支酶的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。