[發(fā)明專利]突變型Taq DNA聚合酶、編碼DNA序列、重組載體、重組表達(dá)細(xì)胞及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110629006.5
• 申請(qǐng)日: 2021-06-04
• 公開（公告）號(hào): CN113186175B
• 公開（公告）日: 2023-08-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 程克文;顧玲;柴常升;王雨薇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 翌圣生物科技（上海）股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/12
• 分類號(hào): C12N9/12;C12N15/54;C12N15/70;C12N1/21;C12Q1/686;C12Q1/6858;C12R1/19
• 代理公司: 蘇州根號(hào)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32276
• 代理人: 朱華慶

本發(fā)明提供一種突變型Taq?DNA聚合酶，其蛋白質(zhì)序列如SEQ?ID?NO：3所示；或者對(duì)SEQ?ID?NO：3所示的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的增加、缺失、修飾或突變，且仍具有與SEQ?ID?NO：3所示序列相當(dāng)?shù)母邼舛鹊鞍啄褪苄砸约案邼舛塞}離子耐受性。并公開了其編碼DNA序列、重組載體、重組表達(dá)細(xì)胞及其應(yīng)用。本發(fā)明的突變型的Taq?DNA聚合酶與野生型的相比有5個(gè)氨基酸突變，具有更好的耐受蛋白、鹽離子的能力和SNP分型能力，同時(shí)在多重PCR建庫方面表現(xiàn)出更好的均一性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明專利涉及突變型Taq?DNA聚合酶、編碼DNA序列、重組載體、重組表達(dá)細(xì)胞及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

DNA聚合酶來源于嗜熱菌（Thermus?aquaticus），其良好的耐熱性能在疾病診斷與治療、傳染病檢測、藥物作用機(jī)理等醫(yī)藥領(lǐng)域廣泛使用。在體外診斷中，人全血直接用于分子診斷，省去核酸提取步驟，大大降低了污染風(fēng)險(xiǎn)，縮短時(shí)間和節(jié)約支出。在細(xì)胞中，DNA聚合酶主要活性是催化DNA（在具備模板、引物、dNTP等的情況下）從5'端點(diǎn)開始復(fù)制到3'端。但血液成分復(fù)雜，對(duì)野生型Taq酶的忠實(shí)性、熱穩(wěn)定性和聚合性能有很大的影響。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種突變型Taq?DNA聚合酶，對(duì)血液具有高耐受性。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種突變型Taq?DNA聚合酶，其蛋白質(zhì)序列如SEQ?ID?NO：3所示；或者對(duì)SEQID?NO：3所示的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的增加、缺失、修飾或突變，且仍具有與SEQ?IDNO?：3所示序列相當(dāng)?shù)母邼舛鹊鞍啄褪苄砸约案邼舛塞}離子耐受性。

本發(fā)明還公開了上述的突變型Taq?DNA聚合酶的編碼DNA序列，其序列如SEQ?IDNO：4所示；或者在SEQID?No：4所示的核苷酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)堿基且仍能編碼得到上述的突變型Taq?DNA聚合酶活性的衍生的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明還公開了一種包含上述的編碼核苷酸的重組載體。

優(yōu)選的，所述重組載體為pET-28a質(zhì)粒。

本發(fā)明還公開了一種重組表達(dá)細(xì)胞，其特征在于：表達(dá)上述的突變型Taq?DNA聚合酶。

優(yōu)選的，所述細(xì)胞為BL21或DE3。

本發(fā)明還公開了上述的突變型Taq?DNA聚合酶在血液樣本PCR擴(kuò)增中的應(yīng)用。

本發(fā)明還公開了上述的突變型Taq?DNA聚合酶在DNA序列多態(tài)性SNP分型檢測中的應(yīng)用。

本發(fā)明的突變型Taq?DNA聚合酶是對(duì)野生型DNA聚合酶進(jìn)行E130N，D188K，F(xiàn)306T，A472I，V669Q的突變而得到的，E130N表示第130位氨基酸由谷氨酸變成了天冬酰胺；D188K表示第188位氨基酸由天冬氨酸變成了賴氨酸；F306T表示其第306位氨基酸由苯丙氨酸變成了蘇氨酸；A472I表示其第472位氨基酸由丙氨酸變成了異亮氨酸；V669Q表示其第669位氨基酸由纈氨酸變成了谷氨酰胺。

本發(fā)明的突變型的Taq?DNA聚合酶與野生型的相比有5個(gè)氨基酸突變，具有更好的耐受蛋白、鹽離子的能力和SNP分型能力，同時(shí)在多重PCR建庫方面表現(xiàn)出更好的均一性。

附圖說明

圖1是實(shí)施例3的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，lane1是marker，lane?2-4BSA濃度分別為0.8mg/ml、1mg/ml、1.2mg/ml，lane5-7?BSA濃度分別為0.8mg/ml、1mg/ml、1.2mg/ml。