[發明專利]一種透明質酸酶活性檢測方法

有效

• 申請號: 202110626688.4
• 申請日: 2021-06-04
• 公開（公告）號: CN113337574B
• 公開（公告）日: 2023-01-31
• 發明（設計）人: 喬莉蘋;郭學平;石艷麗;王秀娟;周寧
• 申請（專利權）人: 華熙生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/34
• 分類號: C12Q1/34
• 代理公司: 北京唐頌永信知識產權代理有限公司 11755
• 代理人: 劉偉;任瑋靜

本發明公開了一種透明質酸酶活性檢測方法，所述檢測是使用分子量為200kDa?800kDa透明質酸鹽作為底物來檢測透明質酸酶活性。本發明所述的檢測方法采用特定分子量的透明質酸鹽作為底物溶液，利用酶解前后的溶液與酸性牛血清白蛋白發生反應，比較酶解前后的濁度變化，從而精確地測定透明質酸酶酶活。

技術領域

本發明涉及酶活性檢測的技術領域，尤其涉及一種透明質酸酶活性檢測方法。

背景技術

透明質酸酶(hyaluronidase，HAase)，也稱玻璃酸酶，是一種能夠特異性水解透明質酸的酶類的總稱。

透明質酸酶于1928年被發現，1940年研究確定命名，1948年即被FDA批準在美國上市，作為擴散劑與其他藥物合用。2004年，FDA批準了兩種透明質酸酶制劑--ISTAPharmaceuticals公司的羊型透明質酸酶(Vitrase)和AmphastarPharmaceuticals公司的牛型透明質酸酶(Amphadase)。2005年底，FDA又批準了2種新型透明質酸酶制劑的上市申請，即PrimaPharm公司研制的純化牛睪丸透明質酸酶(Hydase)和Halozyme制藥有限公司與百特(Baxter)公司共同研制的重組人透明質酸酶(Hylenex)。

美國Halozyme公司的重組人透明質酸酶Hylenex是采用重組DNA技術在CHO細胞中高效表達，高度純化后獲得的產品，具有純度高，免疫原性低等優點，因此快速取代動物提取的透明質酸酶而廣泛應用。臨床上透明質酸酶與其他注射藥物合用，增加后者的吸收和分散，可用于皮下輸液，促進手術及創傷后局部水腫或血腫消散以及皮下尿道造影術之中(改善造影劑硫酸鋇的再吸收)。透明質酸酶還常與麻藥在眼科手術時合用，加快麻醉藥的起效速度。此外，全球生物制藥巨頭如羅氏、強生等公司將重組人透明質酸酶Hylenex和其旗下的數個全球銷量超過50億美金的抗體產品聯用于腫瘤治療，將昂貴的抗體給藥方式由傳統的靜脈輸液替換為皮下注射，極大的簡化了腫瘤病人的治療方案，大幅降低病人和醫療系統的費用支出。

國內上市的透明質酸酶(玻璃酸酶)注射液為上海生化的牛睪丸酶，其檢測方法參照中國藥典執行，裝量為每支1500單位(IU)。

透明質酸酶作為一種藥品，其最關鍵的指標即透明質酸酶的酶活。文獻中報道，透明質酸鹽可以在酸性條件下與血清蛋白絡合，形成混懸液，而當透明質酸鹽經過透明質酸酶的降解，隨著透明質酸鹽分子量的降低，它與酸性條件下的血清蛋白的絡合能力降低，混懸液濁度下降。根據這一原理，在1957年，針對透明質酸酶酶活測定建立了一項國際標準：牛睪丸透明質酸酶凍干粉與乳糖混合制成片劑，通過濁度法測定酶活。這種方法規定0.1mg的透明質酸酶國際標準制劑的酶活為1IU(International Unit)。美國藥典(USP)(2002)采用馬血清作為與HA反應的沉淀劑。2020版《中國藥典》第四部1207《玻璃酸酶測定法》中采用新鮮牛血清或凍干牛血清,先將血清貯備液蒸干然后干燥至恒重后，使得血清固形物含量為1.67％～2％。

與采用牛血清或者馬血清經過干燥至恒重后重新稀釋至一定濃度相比，采用試劑型的牛血清白蛋白直接配制成一定濃度的反應液，試劑更加簡單易得，使用方便。

相應的，藥典中并沒有明確作為底物的透明質酸鹽的分子量范圍，而我們在實踐中發現，過高或者過低分子量的透明質酸鹽作為底物溶液，無法形成良好的“酶活單位-濁度”標準曲線。當透明質酸鹽分子量過高時，在酸性條件下，高分子透明質酸與牛血清白蛋白絡合成團，無法形成穩定的懸濁液，當透明質酸鹽分子量過低時，在酸性條件下，低分子透明質酸與牛血清白蛋白形成的濁度過低，干擾酶活測定。