[發(fā)明專利]一種二代測序方法和文庫構建方法

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• 申請日: 2021-06-03
• 公開（公告）號: CN113337590A
• 公開（公告）日: 2021-09-03
• 發(fā)明（設計）人: 唐沖;童益琴;謝燁明
• 申請（專利權）人: 深圳華大基因股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6806;C40B50/06
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 李小焦;彭家恩

1.一種二代測序方法，其特征在于：包括以下步驟，

轉座子制備步驟，包括將測序接頭包埋進Tn5轉座酶中，形成Tn5轉座子；

DNA樣本處理步驟，包括采用所述Tn5轉座子對待測DNA樣本進行處理，僅僅通過一步處理，即獲得片段化、末端修復和接頭連接的片段化DNA樣本；

Tn5酶促反應終止步驟，包括將終止反應液加入所述DNA樣本處理步驟的反應產物中，終止Tn5酶促反應；

PCR擴增步驟，包括采用帶有雙端barcode的引物組，對所述Tn5酶促反應終止步驟的產物進行PCR擴增，獲得雙端barcode標記的待測DNA樣本；其中，所述引物組能夠特異性的對連接有接頭的片段化DNA樣本進行PCR擴增；

測序文庫制備步驟，包括對PCR擴增產物進行純化，獲得純化產物，將其作為待測DNA樣本的測序文庫；

測序步驟，包括采用測序平臺對所述測序文庫獲取步驟獲得的待測DNA樣本的測序文庫進行測序，獲得測序數(shù)據(jù)；

測序下機數(shù)據(jù)處理步驟，包括使用轉錄本組裝軟件和轉錄本豐度評估軟件，對測序下機數(shù)據(jù)進行序列組裝和組裝片段的豐度評估，獲得測序結果。

2.根據(jù)權利要求1所述的二代測序方法，其特征在于：所述測序下機數(shù)據(jù)處理步驟，還包括根據(jù)豐度評估和長度判定目標序列，用待測DNA樣本的reads比對目標序列，獲得單個堿基的覆蓋度和質量值；所述測序結果包括組裝片段和組裝片段的豐度，以及目標片段的比對文件和相應的文檔說明。

3.根據(jù)權利要求1所述的二代測序方法，其特征在于：所述測序下機數(shù)據(jù)處理步驟，還包括先對測序下機數(shù)據(jù)進行過濾，保留高質量reads；根據(jù)雙端barcode序列，對保留的高質量reads，拆分barcode，得到每個待測DNA樣本的reads；然后再對每個待測DNA樣本進行序列組裝和豐度評估。

4.根據(jù)權利要求1-3任一項所述的二代測序方法，其特征在于：所述測序下機數(shù)據(jù)處理步驟中，所述轉錄本組裝軟件為Trinity、SOAPdenovo-Trans、bridger和MEGAHIT中的至少一種，所述轉錄本豐度評估軟件為RSEM或Salmon。

5.根據(jù)權利要求1-3任一項所述的二代測序方法，其特征在于：所述測序文庫制備步驟，還包括對PCR擴增產物的純化產物進行環(huán)化，獲得環(huán)化DNA，采用環(huán)化DNA制備DNA納米球，將DNA納米球作為待測DNA樣本的測序文庫。

6.根據(jù)權利要求5所述的二代測序方法，其特征在于：所述獲得環(huán)化DNA，包括對環(huán)化反應的產物進行消化處理，消化處理完成后，采用磁珠純化，獲得環(huán)化DNA。

7.根據(jù)權利要求1-3任一項所述的二代測序方法，其特征在于：所述測序文庫制備步驟中，對PCR擴增產物進行純化采用磁珠純化。

8.一種文庫構建方法，其特征在于：包括以下步驟，

轉座子制備步驟，包括將測序接頭包埋進Tn5轉座酶中，形成Tn5轉座子；

DNA樣本處理步驟，包括采用所述Tn5轉座子對待測DNA樣本進行處理，僅僅通過一步處理，即可獲得片段化、末端修復和接頭連接的片段化DNA樣本；

Tn5酶促反應終止步驟，包括將終止反應液加入所述DNA樣本處理步驟的反應產物中，終止Tn5酶促反應；

PCR擴增步驟，包括采用帶有雙端barcode的引物組，對所述Tn5酶促反應終止步驟的產物進行PCR擴增，獲得雙端barcode標記的待測DNA樣本；其中，所述引物組能夠特異性的對連接有接頭的片段化DNA樣本進行PCR擴增；

測序文庫制備步驟，包括對PCR擴增產物進行純化，獲得純化產物，將其作為待測DNA樣本的測序文庫。

9.根據(jù)權利要求8所述的文庫構建方法，其特征在于：所述測序文庫制備步驟，還包括對PCR擴增產物的純化產物進行環(huán)化，獲得環(huán)化DNA，采用環(huán)化DNA制備DNA納米球，將DNA納米球作為待測DNA樣本的測序文庫。

10.根據(jù)權利要求9所述的文庫構建方法，其特征在于：所述獲得環(huán)化DNA，包括對環(huán)化反應的產物進行消化處理，消化處理完成后，采用磁珠純化，獲得環(huán)化DNA；

所述測序文庫制備步驟中，對PCR擴增產物進行純化采用磁珠純化。