[發(fā)明專(zhuān)利]一種基于線(xiàn)性質(zhì)粒載體從基因組文庫(kù)中靶向克隆目標(biāo)片段的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110620674.1
• 申請(qǐng)日: 2021-06-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113355338B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-04-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 元英進(jìn);崔有志;李炳志;周見(jiàn)庭
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/63
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/63;C12N15/10
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 潘穎

本發(fā)明涉及靶向克隆技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于線(xiàn)性質(zhì)粒載體從基因組文庫(kù)中靶向克隆目標(biāo)片段的方法。包括：帶有tos的環(huán)形質(zhì)粒通過(guò)PCR擴(kuò)增方式，在體外擴(kuò)增并使用TelN原端粒酶酶切獲得線(xiàn)性化的克隆載體同時(shí)，在載體兩端引入與目標(biāo)基因組片段側(cè)翼相同的序列，得到高濃度線(xiàn)性化載體；將線(xiàn)性化載體與基因組文庫(kù)進(jìn)行體外組裝，得到組裝產(chǎn)物；在宿主基因中整合入TelN蛋白表達(dá)基因，得到整合有TelN蛋白的宿主；將組裝產(chǎn)物轉(zhuǎn)入整合有TelN蛋白的宿主中，篩選目標(biāo)片段。本發(fā)明技術(shù)具有高效、靶向性強(qiáng)、低成本、大容量、易操作等特點(diǎn)。基于該發(fā)明能實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組大片段的高效率一步克隆，實(shí)現(xiàn)最大156kb長(zhǎng)度基因組序列的克隆。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及靶向克隆技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于線(xiàn)性質(zhì)粒載體從基因組文庫(kù)中靶向克隆目標(biāo)片段的方法。

背景技術(shù)

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的高速發(fā)展，基因組全局信息不斷展示在科學(xué)家面前，拓寬了生命基因組信息的知識(shí)。基因組中被忽視的DNA區(qū)域在細(xì)胞代謝中發(fā)揮著多種功能，揭示了非編碼區(qū)域和內(nèi)含子的重要性。這使得以前被稱(chēng)為基因組上的所謂“垃圾序列”慢慢擺脫最初認(rèn)為的“無(wú)作用”的序列。同時(shí)，更多新的生物合成基因簇被發(fā)現(xiàn)用于有價(jià)值的生物抗生素、藥物和生物燃料的生產(chǎn)。無(wú)論是“垃圾序列”還是次級(jí)代謝產(chǎn)物基因通路，往往意味著長(zhǎng)度大于常規(guī)的基因序列。針對(duì)超長(zhǎng)基因序列的研究，往往可以更加全面解析編碼區(qū)內(nèi)含子或者非編碼區(qū)序列對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控關(guān)系。但目標(biāo)基因組序列往往由于序列長(zhǎng)度過(guò)長(zhǎng)，獲取困難，使相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜覍?duì)完整基因簇研究望而卻步。所以，目前急需一種高效獲取特定區(qū)域基因組序列方法，促進(jìn)全局基因信息的研究，擺脫以往使用cDNA進(jìn)行研究基因功能的束縛。

目前獲得目標(biāo)DNA序列的主要方法是基因合成或克隆。隨著合成生物學(xué)的出現(xiàn)，DNA合成技術(shù)實(shí)現(xiàn)重大技術(shù)飛躍，在實(shí)驗(yàn)室就可以合成上百萬(wàn)對(duì)堿基對(duì)。盡管如此，超長(zhǎng)DNA的合成需要花費(fèi)大量的時(shí)間和精力。傳統(tǒng)的DNA序列獲取方法包括聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase?chain?reaction,PCR)和基因克隆。常規(guī)PCR反應(yīng)一般使用提取的基因組為模板，通過(guò)引物在特定基因序列區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，一般最大擴(kuò)增長(zhǎng)度為10kb，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足需求，并且PCR對(duì)重復(fù)序列或者復(fù)雜序列擴(kuò)增能力一般。

因此，目前對(duì)完整基因的研究一直依賴(lài)于BAC或YAC文庫(kù)。YAC文庫(kù)依賴(lài)酵母宿主的同源重組能力，雖然克隆片段較大，但是對(duì)片段的克隆和保存沒(méi)有BAC文庫(kù)穩(wěn)定。然而，目前BAC文庫(kù)不完整，同時(shí)購(gòu)買(mǎi)和篩選耗時(shí)耗力，對(duì)于大部分意向基因仍難以從商業(yè)化的BAC庫(kù)中獲得。

為了滿(mǎn)足大基因簇的需要，近年來(lái)出現(xiàn)了許多針對(duì)特定基因組片段的克隆方法。比如，TAR克隆(transformation-associated?recombination)是利用具有同源重組能力的釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)為宿主，將YAC載體與酶切基因組片段混合，通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)至釀酒酵母內(nèi)。載體與目標(biāo)片段末端帶有一定長(zhǎng)度的同源基因序列，在釀酒酵母體內(nèi)具有同源序列的載體與特定片段組裝成YAC質(zhì)粒。同時(shí)，帶有目的DNA序列的質(zhì)粒需要電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌內(nèi)擴(kuò)增進(jìn)一步增加產(chǎn)量。TAR克隆效率低，對(duì)復(fù)雜序列克隆困難。

大腸桿菌相較于釀酒酵母宿主，對(duì)片段的保存更加穩(wěn)定，這是目前對(duì)未知生物高通量測(cè)序普遍使用BAC文庫(kù)的主要原因。對(duì)于大腸桿菌宿主，近些年開(kāi)發(fā)了CATCH(Cas9-Assisted?Targeting?of?CHromosome?Segments)，CAPTURE(Cas12a-assisted?precisetargeted?cloning?using?in?vivo?cre-lox?recombination)，ExoCET(ExonucleaseCombined?with?RecET?recombination)等靶向克隆技術(shù)。CATCH技術(shù)主要改進(jìn)對(duì)目標(biāo)基因序列的獲取方式，使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)需求序列進(jìn)行靶向剪切，得到目標(biāo)序列，然后體外使用傳統(tǒng)的Gibson?assembly組裝，電轉(zhuǎn)入大腸桿菌宿主中，由抗性培養(yǎng)基和PCR篩選出陽(yáng)性克隆。但CATCH克隆技術(shù)需要專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)CRISPR系統(tǒng)，步驟繁多，存在脫靶風(fēng)險(xiǎn)以及剪切效率問(wèn)題，并且一次只能靶向一段序列。