[發明專利]一種改進的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3定量檢測方法

在審

• 申請號: 202110618052.5
• 申請日: 2021-06-03
• 公開（公告）號: CN113391070A
• 公開（公告）日: 2021-09-14
• 發明（設計）人: 李福川;石立冉;魏琳;關靖雯;韓乃寒;王文爽;許瑩瑩
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/574;G01N33/68;G01N21/31;G01N21/78;C07K16/18;C07K16/06
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 陳桂玲

本發明涉及一種改進的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3定量檢測方法。包括步驟如下：(1)將待測樣品酶處理；(2)將步驟(1)中酶處理后的待測樣品用雙抗夾心ELISA法檢測吸光度；(3)根據標準品繪制標準曲線；(4)根據步驟(2)中得到的待測樣品的吸光度和步驟(3)所得標準曲線，測算出待測樣品中磷酯酰肌醇蛋白聚糖3的含量。本發明先用糖胺聚糖降解酶將磷酯酰肌醇蛋白聚糖3核心蛋白羧基端的兩條HS側鏈降解，然后再雙抗夾心ELISA法進行檢測，可以顯著的提高磷酯酰肌醇蛋白聚糖3檢測的靈敏度，穩定性和專一性，定量檢測線為pg級。解決了現有檢測過程中存在的操作步驟繁瑣、耗時較長、檢測靈敏度低、結果重現性差等問題。

技術領域

本發明涉及一種改進的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3定量檢測方法，屬于生物化學和醫學技術領域。

背景技術

蛋白聚糖(Proteoglycan，PGs)是由一個核心蛋白與一條或多條糖胺聚糖(Glycosaminoglycans，GAGs)側鏈通過共價鍵連接形成的一類生物大分子(Iozzo.1998；Iozzo and Schaefer.2015)。由于PGs核心蛋白的種類不同及GAG側鏈的復雜性使得PGs的結構異常復雜，同樣由于GAGs側鏈的復雜性和多樣性使PGs具有各種重要的生物學功能(Syrokou et al.1999；Baghy.et al.2016；Wight.2018)。如：調節細胞信號轉導、參與細胞的增殖及分化(Mizumoto and Sugahara 2013；Yamada and Sugahara et al.2008)、促進腫瘤中的發生和轉移等等(Malavaki et al.2008；Hashiguchi et al.2010；Esko andSelleck.2002；Kreuger et.al.2006；Filmus 2001)。但由于GAGs的存在也為蛋白聚糖的檢測帶來了巨大的困難，GAGs是由含有氨基己糖二糖單元重復鏈接而成的聚陰離子線性多糖，易與各種蛋白相互作用，尤其是血清中含有大量的蛋白和多肽類物質，更容易導致對核心蛋白的包裹，從而干擾抗體蛋白對核心蛋白的有效識別和結合，進而影響檢測的效果。

磷酯酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3，GPC3)作為一種重要的細胞膜表面蛋白聚糖，是Glypicans家族的一員，由580個氨基酸組成的大小為70kDa的核心蛋白和兩條連接在核心蛋白羧基端附近的HS側鏈組成，且通過糖磷脂酰肌醇(GPI)錨定附著在細胞膜上。從細胞膜上脫落下來的成熟的GPC3在Arg358-Cys359鍵處經呋喃處理后可以生成一個40kDa的氨基端亞基和一個30kDa的羧基端亞基，該亞基通過二硫鍵連接(De Cat et.al.2003)。大量研究表明：GPC3在70％以上的肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)患者體內特異表達，而在良性病變、肝硬化、肝炎和健康成人的組織中不表達，在HCC組織和HCC患者的血清中GPC3水平顯著上調，使得GPC3成為了HCC的特異性生物標志物(Haruyama andKataoka.2016；Yang et al.2014)。

目前，國內外針對于GPC3的檢測方法的進行了大量的研究，并取得了一系列重要的研究成果。Yu等人建立了化學發光免疫檢測法，Zhang等人研究者研究開發了競爭性放射免疫檢測法，Zhao等人構建并應用于Glypican-3(GPC3)靶向成像技術的適配體介導的USPIO(Apt-USPIO)探針及2020年李桂銀創立的適配體納米生物傳感器的方法特異檢測GPC3等。但在實際應用中，酶聯免疫檢測依然是GPC3檢測中最為常用的檢測方法。Filmus實驗室建立的GPC3夾心ELISA方法，是目前HCC臨床診斷研究中，血清GPC3檢測普遍采用的方法(Capurro.et al.2003)。但是，常規酶聯免疫檢測方法在GPC3檢測中存在檢測靈敏度低，結果重現性差和耗時等弊端，因此也阻礙了該方法在HCC臨床診斷方面的應用，特別是在肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)早期階段，血清中GPC3的含量極低，且血清中成分復雜使得應用于HCC的早期臨床診斷時遇到了極大的困難。因此，急需對GPC3酶聯免疫檢測方法進行改進。