[發(fā)明專利]一種多剪切力微流控芯片中單細(xì)胞精準(zhǔn)圖案化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110613404.8
• 申請日: 2021-06-02
• 公開（公告）號: CN113337451B
• 公開（公告）日: 2023-03-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孟桂先;董媛;姜勇;方芳;盧欣博;趙臣;郭健;劉微;張磊;孫美艷;朱潔
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林醫(yī)藥學(xué)院
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00
• 代理公司: 北京遠(yuǎn)大卓悅知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11369
• 代理人: 劉小嬌

本發(fā)明公開了一種多剪切力微流控芯片中單細(xì)胞精準(zhǔn)圖案化方法，包括：步驟一、在圖案印章帶有圖案的一側(cè)滴加蛋白液，避光孵育后，將圖案印章沾洗后吹干；步驟二、將圖案印章按壓在基底玻片上并靜置，得到帶有多個(gè)蛋白微圖案區(qū)域的基底玻片；步驟三、將基體玻片放入培養(yǎng)皿中，并向培養(yǎng)皿中注入細(xì)胞懸液后，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在多個(gè)蛋白微圖案區(qū)域得到貼壁生長的細(xì)胞圖案；步驟四、將基底玻片貼放在PDMS芯片底部，利用PDMS芯片連通至基底玻片的抽氣孔和芯片底部的負(fù)壓真空通道進(jìn)行真空負(fù)壓密封，使基底玻片與PDMS芯片密封；步驟五、在PDMS芯片的加樣孔中加入液體，液體分流后進(jìn)入多個(gè)反應(yīng)室，由反應(yīng)室一側(cè)流向另一側(cè)對細(xì)胞圖案進(jìn)行流體剪切力刺激。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，更具體的是，本發(fā)明涉及一種多剪切力微流控芯片中單細(xì)胞精準(zhǔn)圖案化方法。

背景技術(shù)

從二十世紀(jì)七十年代開始，圖案化技術(shù)開始用于生物分子和細(xì)胞。細(xì)胞圖案化技術(shù)主要分為兩類：一類是通過表面修飾形成細(xì)胞黏附生長的圖案化區(qū)域，使細(xì)胞選擇性地黏附生長形成圖案；另一類是通過可移除的物理障礙將細(xì)胞限制在圖案化的區(qū)域生長，形成細(xì)胞圖案。

在現(xiàn)有技術(shù)中，細(xì)胞圖案化的方法主要分為光刻和軟刻蝕。光刻利用紫外光將掩膜上的幾何圖案轉(zhuǎn)移到基底上，首先在基底上鋪一層光敏聚合物光刻膠，然后基底在光掩膜覆蓋下曝光顯影形成圖案，將表面修飾材料吸附在基底表面后，將基底浸入到有機(jī)溶劑中將光刻膠洗脫，這樣就在底面上形成表面修飾蛋白質(zhì)的圖形，細(xì)胞就會按照已修飾的圖形粘附和生長，形成細(xì)胞圖案。

軟刻蝕技術(shù)通過使用高分子聚合物，例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)，在有圖案的底膜上形成印章，達(dá)到復(fù)制微米甚至納米尺度結(jié)構(gòu)的目的。常用到的有微接觸印刷(Mirco-contact printing,μCP)、微流控圖案化以及模板圖案化。其中，傳統(tǒng)的微接觸印刷只能形成一種或兩種分子圖案，只有使用多級印章才可以形成多種分子的圖案，但操作過程比較復(fù)雜。微流控圖案化是一個(gè)與微接觸印刷相關(guān)的過程，但與微接觸印刷不同的是PDMS模板底面具有微通道網(wǎng)絡(luò)。由于微流控圖案化是運(yùn)用不同分子的溶液來形成圖案，因此一般來說每一種分子的圖案在表面上都是連續(xù)分布的，這就限制了圖案形狀的多樣性。模板圖案化是一種不需要對基底進(jìn)行化學(xué)修飾也可進(jìn)行細(xì)胞圖案化的方法，但多用于適用于制備圓形、方形等簡單圖案比較容易。

無論是微接觸印刷μCP和微接觸剝離為代表的軟光刻圖案化，還是光刻技術(shù)的圖案化，亦或是微通道、微孔限域的圖案化技術(shù)，都可以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞水平的精準(zhǔn)控制。然而在微流控芯片的微米級通道中實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞圖案化，卻一直沒有得到有效解決。

2006年Lab-on-chip雜志報(bào)道一種將利用PDMS印章作為保護(hù)層，將微流控芯片等離子鍵合與蛋白圖案一步化完成，但是細(xì)胞圖案的控制尺度只能達(dá)到50-100μm，無法實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞控制，單細(xì)胞控制要求精度在1μm～30μm。這樣無法滿足體現(xiàn)微流控芯片在模擬細(xì)胞生物物理、化學(xué)、機(jī)械環(huán)境的優(yōu)勢。近二十年，在實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞圖案化的基礎(chǔ)上，給細(xì)胞施加機(jī)械、藥物等刺激時(shí)，只能采用傳統(tǒng)的模式，構(gòu)建三明治結(jié)構(gòu)的流室，采用按壓密封或者負(fù)壓密封的方式。

因此，本發(fā)明提供了一套簡單、快捷的微流控芯片中單細(xì)胞精準(zhǔn)圖案化的方法，為細(xì)胞空間位置、多條件微環(huán)境與細(xì)胞相互作用領(lǐng)域的研究提供新的研究技術(shù)與策略。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明設(shè)計(jì)開發(fā)了一種多剪切力微流控芯片中單細(xì)胞精準(zhǔn)圖案化方法，解決芯片中單細(xì)胞控制精度問題，控制精度達(dá)到1μm～30μm。

本發(fā)明的另一個(gè)技術(shù)目的是，實(shí)現(xiàn)芯片中圖案化、流體刺激、真空分裝一步實(shí)現(xiàn)的問題；解決多圖案與多剪切同步刺激的問題。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

步驟一、對基底玻片進(jìn)行預(yù)處理；在圖案印章帶有圖案的一側(cè)滴加促細(xì)胞貼壁的蛋白液(纖維粘連蛋白Fibronectin或膠原蛋白Collagen等)，避光孵育后，將所述圖案印章沾洗后吹干；