[發明專利]一種Merkel細胞多瘤病毒熒光定量PCR檢測方法

在審

• 申請號: 202110609593.1
• 申請日: 2021-06-01
• 公開（公告）號: CN113355457A
• 公開（公告）日: 2021-09-07
• 發明（設計）人: 周顯鳳
• 申請（專利權）人: 南昌市疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12R1/93
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識產權代理有限公司 11616
• 代理人: 王小燕

1.一種Merkel細胞多瘤病毒熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，該方法以Merkel細胞多瘤病毒的大T抗原基因LTag為檢測對象。

2.根據權利要求1所述的一種Merkel細胞多瘤病毒熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，該方法采用的PCR引物為：

正向引物5’-TTGTCTCGCCAGCATTGTAG-3’；

反向引物5’-ATATAGGGGCCTCGTCAACC-3’。

3.根據權利要求1所述的一種Merkel細胞多瘤病毒熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，該方法以待測樣品為模板，以序列為5’-TTGTCTCGCCAGCATTGTAG-3’和5’-ATATAGGGGCCTCGTCAACC-3’的DNA片段為正向引物和反向引物，執行熒光定量PCR擴增。

4.根據權利要求3所述的一種Merkel細胞多瘤病毒熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，在所述執行熒光定量PCR擴增之前，先以標準品為模板，以序列為5’-TTGTCTCGCCAGCATTGTAG-3’和5’-ATATAGGGGCCTCGTCAACC-3’的DNA片段為正向引物和反向引物，執行熒光定量PCR擴增，繪制標準曲線。

5.根據權利要求4所述的一種Merkel細胞多瘤病毒熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，所述標準品是由以下方法制備的：人工合成兩端分別含有BamHI和XbaI限制性內切酶位點的MCV LTag全基因序列，克隆至pTA22質粒，得到pTA22-MCV質粒，對質粒DNA進行核酸定量和純度檢測，再進行稀釋，得到若干已知濃度的標準品。

6.根據權利要求3～5任一項所述的一種Merkel細胞多瘤病毒熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，所述熒光定量PCR擴增的反應體系為：DNA模板2μL，正向引物和反向引物混合物2.5μL、2×Thunderbird SYBR qPCR Mix 10μL、ddH₂O 3μL。

7.根據權利要求3～5任一項所述的一種Merkel細胞多瘤病毒熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，所述熒光定量PCR擴增的反應程序為：95℃1min變性；95℃15s，60℃1min進行熒光信號收集，45個循環。