[發明專利]利用LC-MS/MS高效定性定量分析植物代謝修飾組的方法

在審

• 申請號: 202110607759.6
• 申請日: 2021-06-01
• 公開（公告）號: CN113325107A
• 公開（公告）日: 2021-08-31
• 發明（設計）人: 羅杰;王守創;楊君;劉賢青;陳日東
• 申請（專利權）人: 海南大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72;G01N27/62
• 代理公司: 成都方圓聿聯專利代理事務所(普通合伙) 51241
• 代理人: 李鵬

1.利用LC-MS/MS高效定性定量分析植物代謝修飾組的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、植物代謝修飾組樣品制備

(1)取新鮮植物葉片樣品，放在液氮中保存；

(2)配制提取液；

(3)將植物葉片真空冷凍干燥后，利用研磨儀研磨成粉末，加入水溶性和脂溶性提取液，然后劇烈渦旋使粉末和提取液充分混勻，每10min劇烈渦旋一次，渦旋3次后放入4℃冰箱靜置12h；

(4)將水溶性和脂溶性樣品從4℃冰箱取出，在10,000g轉速下4℃離心8min，分別吸取水溶性和脂溶性上清，并按1:1比例混勻；利用微孔濾膜進行過濾，將過濾后的上清液裝在進樣瓶中，保存在-80℃中準備用于LC-MS分析；

S2、儀器準備

(1)色譜

液相色譜儀流動相A相為體積百分比為0.04％乙酸水溶液，流動相B相為體積百分比為0.04％乙酸乙腈溶液；液相色譜采用線性洗脫梯度，0min，5％B，0-10min線性升至95％B并保持1min，11-11.1min恢復初始5％B，并保持5％B至14min；流量為0.3mL/min，進樣量為2μL；進樣器溫度為10℃，柱溫為40℃；

(2)質譜條件：

A.AB Sciex QTRAP 6500+串聯四級桿線性離子阱質譜儀：

S3、6500neutral loss獲取碎片，匯總去重

首先利用6500質譜儀以NL-IDA-EPI模式進行數據采集，其中loss of參數n的范圍為14,15,16,17,18,……298,299,300，以1Da為間隔遞增，母離子掃描范圍為:n+5-1000；

S4、將步驟S3模式采集的一級質譜信息母離子Q1、二級質譜信息子離子Q3及其豐度、以及其他二級質譜信息Q4，Q5，Q6及其豐度……、色譜峰保留時間RT進行匯總，篩掉具有相同母離子、子離子碎片和RT的離子對；

S5、將篩選的離子對利用6500質譜儀的sMRM模式進行檢測，每個方法文件中包含1200個離子對，然后利用Analyst軟件進行數據處理，利用定量積分方法篩選出峰強度在1000cps以上的離子對；

S6、將峰強度在1000cps的離子對通過6500質譜儀的MRM-IDA-EPI模式進行檢測，每個方法文件中包含80個離子對，采集高質量的二級質譜碎片信息，進一步更新一級質譜信息母離子，保留時間RT，以及碎片對應的豐度，得到廣泛靶向的植物修飾組數據清單；同時利用QE質譜儀對上述數據清單以FS/AIF/dd-MS2模式進行數據采集，獲取具有高分辨率的母離子；通過比對具有高分辨率的母離子Q1，離子對碎片Q3，Q4，Q5…,保留時間RT和母離子的裂解模式等進行去重對齊，建立包含高分辨母離子Q1，離子對碎片Q3，Q4，Q5…,保留時間RT的高質量植物代謝修飾組數據庫；最后后通過sMRM進行植物代謝修飾組的定量分析。

2.根據權利要求1所述的利用LC-MS/MS高效定性定量分析植物代謝修飾組的方法，其特征在于，S1中所述的水溶性提取液構成比例為V_甲醇：V_水：V_乙酸＝75:25:0.04，脂溶性提取液構成比例為V_甲醇：V_乙酸＝100:0.04，其中V代表體積；所使用的甲醇和乙酸為色譜純試劑，去離子水用純化系統處理獲得。

3.根據權利要求1所述的利用LC-MS/MS高效定性定量分析植物代謝修飾組的方法，其特征在于，S1中條件為30Hz，1.0min；先將提取液放在4℃冰箱預冷，分別稱取3g植物葉片干粉末按照1g:2ml加入水溶性和脂溶性提取液。