[發明專利]一種提高GFAP蛋白表達量的基因及其可溶性表達方法

在審

• 申請號: 202110607070.3
• 申請日: 2021-06-01
• 公開（公告）號: CN113416734A
• 公開（公告）日: 2021-09-21
• 發明（設計）人: 趙恒;張敏;江海波
• 申請（專利權）人: 蘇州順友芯智能科技有限公司
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/70;C12N15/66;C07K14/47
• 代理公司: 蘇州科洲知識產權代理事務所(普通合伙) 32435
• 代理人: 李奎鋒

本發明涉及一種提高GFAP蛋白表達量的基因及其可溶性表達方法，通過對膠質纖維酸性蛋白GFAP基因堿基序列進行優化，得到優化后的GFAP?opt基因序列SEQ ID NO.2，有效的使膠質纖維酸性蛋白在大腸桿菌中大量表達。通過進一步對pGEX?4T?2載體進行改造，增加了OmpA信號肽，所述信號肽序列為SEQ ID NO.3。本研究通過融合OmpA信號肽，使膠質纖維酸性蛋白在大腸桿菌中的分泌增加，有效改善了膠質纖維酸性蛋白包涵體形式的表達。

技術領域

本發明涉及生物制藥領域，具體涉及一種提高GFAP蛋白表達量的基因及其可溶性表達方法。

背景技術

膠質纖維酸性蛋白(GFAP)是中樞神經系統所獨有的特異性細胞骨架蛋白，是星形膠質細胞唯一表達的一種標志性蛋白，星形膠質細胞廣泛分布于中樞神經系統各個部位，約占正常成年人腦細胞總數的40％。GFAP則是星形膠質細胞和星形膠質細胞源性腫瘤的標志蛋白，對神經元起支撐和營養作用，參與星形膠質細胞的許多生物學功能，包括細胞的增殖與分裂、維護血腦屏障的正常生理功能、自噬、維持神經遞質的平衡等。GFAP是星形膠質細胞特有的中間絲蛋白，是膠質瘤的標志蛋白。在正常情況下，細胞胞質內的GFAP循環降解，血液中GFAP水平較穩定；而病理條件下，如病人的中樞神經系統受到損傷，其星形膠質細胞遭受破傷或壞死時，GFAP從膠質細胞中流出，穿過血腦屏障進入血液中，使GFAP濃度上調，因此GFAP在惡性膠質瘤中表現出異常過度表達。GFAP表達水平異常與多種遺傳病和精神病相關，如亞歷山大病、唐氏綜合征、精神分裂癥、情感型雙極性疾患和抑郁癥。目前，GFAP表達水平已經作為中風、腦外損傷、星型細胞源性膠質瘤等多種疾病的診斷標志之一。另外GFAP主要用于星型膠質瘤，包括星型細胞瘤，星型母細胞瘤，混合膠質瘤，多形性膠質母細胞瘤和非星型細胞瘤，包括部分少數膠質細胞瘤，多數室管膜瘤等中樞神經系統腫瘤的診斷和鑒別診斷。

在膠質纖維酸性蛋白抗原制備過程中，采取pGEX-4T-2載體對其全長基因進行表達，發現其原序列在大腸桿菌中不好表達。此外表達的蛋白都以包涵體形式存在。一方面增加純化成本，另一方面純化過程可能造成蛋白失活。

為了解決上述技術難題，本發明提供了一種提高GFAP蛋白表達量的基因GFAP-opt及其表達方法。

發明內容

本發明在一個方面，提供了一種GFAP-opt基因，其序列如SEQ.ID.No.2所示。

在另一個方面，本發明提供了一種所述GFAP-opt基因在提高GFAP蛋白表達量中的作用。

在一個實施例中，本發明提供了一種pGEX-4T-2表達載體，其表達所述的GFAP-opt基因，命名為pGEX-4T-2-GFAP-opt。

在一個或多個實施例中，所述載體其進一步包括OmpA信號肽，構建得到pGEX-4T-2-OmpA-GFAP-opt重組質粒。

在一實施例中，所述OmpA信號肽的序列如SEQ.ID.No.3所示。

在一個方面，本發明提供了一種所述pGEX-4T-2-opma-GFAP-opt載體在提高GFAP蛋白可溶性表達中的作用。

在另一個方面，本發明提供了一種提高GFAP蛋白表達量的方法，其特征在于：使用pGEX-4T-2-GFAP-opt載體表達GFAP蛋白。

在本發明的一個方面，提供了一種提高GFAP蛋白可溶性表達的方法，其特征在于：使用pGEX-4T-2-OmpA-GFAP-opt重組質粒表達GFAP蛋白。