[發(fā)明專利]一種檢測綿羊FASN基因單核苷酸多態(tài)性的方法及其在肉質(zhì)性狀早期篩選中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110606432.7
• 申請(qǐng)日: 2021-05-28
• 公開（公告）號(hào): CN113265471B
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 樂祥鵬;劉重陽;李發(fā)弟;秦芳;劉星
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘭州大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責(zé)任公司 61200
• 代理人: 范巍

本發(fā)明公開了一種檢測綿羊FASN基因單核苷酸多態(tài)性的方法及其在肉質(zhì)性狀早期篩選中的應(yīng)用，包括以下步驟：提取湖羊組織DNA樣品、FASN基因突變位點(diǎn)g.5157A＞G和g.9413T＞C的單核苷酸多態(tài)性分型；通過對(duì)湖羊FASN基因單核苷酸多態(tài)性與肌內(nèi)脂肪含量的關(guān)聯(lián)分析，表明對(duì)湖羊FASN基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的分型檢測可以獲得用于湖羊肌內(nèi)脂肪含量性狀早期篩選的分子標(biāo)記。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及單核苷酸多態(tài)性(SNP)分子標(biāo)記的篩選與檢測，具體涉及一種將DNA池和改進(jìn)的多重高溫連接酶檢測反應(yīng)(imLDR)技術(shù)相結(jié)合，檢測綿羊脂肪酸合成酶(FASN)基因單核苷酸多態(tài)性的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記和分子標(biāo)記是目前常見的四種遺傳標(biāo)記類型。通過遺傳標(biāo)記可以對(duì)基因座在家系中的傳遞進(jìn)行追蹤，其本身具有可識(shí)別性和遺傳性。分子標(biāo)記是DNA水平的遺傳變異。單核苷酸多態(tài)性(SNP)主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，是基因組中分布較為廣泛的遺傳標(biāo)記。SNP可由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換或顛換所引起，也可由堿基的插入、缺失所導(dǎo)致。根據(jù)SNP在基因中所處的位置不同可分為編碼區(qū)SNP和非編碼區(qū)SNP。其中，位于基因編碼區(qū)的SNP(coding SNP，cSNP)可以分為同義突變(堿基改變前后基因編碼氨基酸相同，不會(huì)改變蛋白質(zhì)的序列，但可能導(dǎo)致翻譯效率改變)和非同義突變(堿基改變前后基因編碼氨基酸發(fā)生改變，從而影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能)。因此對(duì)由編碼區(qū)核苷酸的突變產(chǎn)生的SNP進(jìn)行檢測和分析對(duì)育種工作具有重要意義。

目前，SNPs的檢測方法主要有以下幾種：DNA測序法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)—單鏈構(gòu)象多態(tài)(Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP)與DNA測序結(jié)合法、等位特異性PCR(Allele Specific PCR，AS-PCR)法、引物延伸法和寡核苷酸連接反應(yīng)等。其中，DNA測序法結(jié)果準(zhǔn)確，但對(duì)儀器設(shè)備、人員技術(shù)的要求較嚴(yán)格，且檢測費(fèi)用較高；PCR-SSCP存在操作繁瑣、耗時(shí)長等問題；在SNP位點(diǎn)檢測中AS-PCR需針對(duì)特定基因位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，而利用引物延伸法和寡核苷酸連接反應(yīng)技術(shù)對(duì)儀器和人員條件要求較高，目前并未得到普遍應(yīng)用。

改進(jìn)的多重高溫連接酶檢測反應(yīng)(improved multiple ligase detectionreaction，imLDR)技術(shù)，是經(jīng)由連接酶檢測反應(yīng)(ligase detection reaction，LDR)技術(shù)改良后的基因分型技術(shù)，其成本低、速度快、準(zhǔn)確性高、僅一次反應(yīng)就可同時(shí)檢測16～30個(gè)位點(diǎn)。imLDR進(jìn)行分型檢測的原理是先將目標(biāo)SNPs位點(diǎn)所在區(qū)段采用多重PCR反應(yīng)在一個(gè)體系內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)外切核酸酶和蝦堿酶(Exol/SAP)純化后作為后續(xù)連接酶反應(yīng)的模板；在一個(gè)連接反應(yīng)中，每個(gè)位點(diǎn)包含兩個(gè)5’端等位基因特異探針以及緊隨其后的一條Y端位點(diǎn)的熒光標(biāo)記的特異探針；連接產(chǎn)物通過ABI3730XL的毛細(xì)管電泳區(qū)分，原始數(shù)據(jù)文件用GeneMapper4.1軟件分析。相比于LDR技術(shù)，imLDR技術(shù)提高了準(zhǔn)確性和分型的成功率。

肌內(nèi)脂肪(IMF)主要由磷脂、三酰甘油酯、半磷酸、二磷酸甘油酯、膽固醇和固醇酯以及脂肪酸(fatty acid，F(xiàn)A)組成，其沉積于肌束、肌內(nèi)外膜，使肌肉表面形成大理石花紋，是肉質(zhì)評(píng)價(jià)中重要的表觀含量性狀。基因、品種、管理和營養(yǎng)都不同程度的影響著IMF沉積。IMF與肉的嫩度、多汁性、香味、大理石花紋評(píng)分、眼肌面積大小呈顯著正相關(guān)，在一定范圍內(nèi)隨著IMF含量的增加，肉質(zhì)口感、嫩度與風(fēng)味都得到提升。IMF的沉積出現(xiàn)在個(gè)體發(fā)育的較晚階段，并晚于機(jī)體其他部位脂肪的沉積，其組成與機(jī)體其它部位脂肪的組成也有較大的差異。研究表明，IMF含量在4％至5％的羊肉品質(zhì)最佳，為了改善IMF含量，除了關(guān)注品種、性別、年齡、飼料營養(yǎng)成分以外，利用與IMF含量相關(guān)的候選基因從遺傳方面進(jìn)行品種改良和選育具有重要研究意義。