[發明專利]一種HLA-B27等位基因檢測方法及檢測試劑盒

在審

• 申請號: 202110601113.7
• 申請日: 2021-05-31
• 公開（公告）號: CN113564240A
• 公開（公告）日: 2021-10-29
• 發明（設計）人: 陸利;鄭舒凱;吳惠容;肖蓁蓁;吳松;楊健;陳仕安
• 申請（專利權）人: 德必碁生物科技（廈門）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 福州順升知識產權代理事務所(普通合伙) 35242
• 代理人: 黃勇亮

1.一種HLA-B27等位基因檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、采用磁珠法、柱提法核酸分離純化對核酸提取純化；

步驟2、采用TaqMan探針法的實時PCR法進行HLA-B27實時熒光PCR檢測。

2.根據權利要求1所述的一種HLA-B27等位基因檢測方法，其特征在，所述步驟2中HLA-B27實時熒光PCR法的由一組或多組針對HLA-B27等位基因的引物探針組成。

3.根據權利要求2所述的一種HLA-B27等位基因檢測方法，其特征在，針對HLA-B27等位基因的設計的引物由多組組成，設計特異性引物在待檢測區域的上游或下游；設計的特異性引物3’端距離待檢測區域5‘端為1～30個堿基；設計的特異性引物上游引物、下游引物或上下游引物3‘端存在錯配修飾；設計的特異性引物3’端錯配修飾堿基位置為3‘端倒數第1～5位。

4.根據權利要求3所述的一種HLA-B27等位基因檢測方法，其特征在，所述檢測方法為針對HLA-B27等位基因設計特異性的引物探針，基于TaqMan探針法的實時熒光檢測方法。

5.一種HLA-B27等位基因分型檢測試劑盒；其特征在于，包括PCR反應液A、PCR反應液B、酶混合液、陽性對照品及陰性對照品；

PCR反應液A包含5～250mM鉀鹽、0.5～15mM二價金屬離子、酶活性劑、50～500mM銨鹽及0.2～10mM dNTPs。

所述鉀鹽包含但不限于KCl、K2SO4、KNO3中的一種或多種；

所述二價金屬離子包含但限于Mg2+、Mn2+、Zn2+中的一種或多種；

所述的酶活性劑包括1～10％甘油、0.01～0.2％BSA；

所述銨鹽包含但不限于NH₄Cl、NH₄2SO₄、NH₄NO₃中的一種或多種；

PCR反應B包含2.5～40uM引物和5～100uM探針。

6.根據權利要求5所述的一種HLA-B27等位基因分型檢測試劑盒，其特征在于，所述鉀鹽為KCl，所述二價金屬離子為Mg2+；所述的酶活性劑為1.2％甘油及0.02％BSA，所述銨鹽為NH₄Cl。

7.根據權利要求6所述的一種HLA-B27等位基因分型檢測試劑盒，其特征在于，所述KCl的濃度優先地170mM；所述Mg2+的濃度優先的2.5mM；所述dNTPs濃度優先地0.2mM。

8.根據權利要求7所述的一種HLA-B27等位基因分型檢測試劑盒，其特征在于，所述引物包括B27基因：SEQ1～SEQ8、內參基因引物：SEQ9～SEQ10,B27基因：P1～P3；內參基因P4。

9.根據權利要求8所述的一種HLA-B27等位基因分型檢測試劑盒，其特征在于，所述B27基因的引物組合，Group1:SEQ 1SEQ 5、Group2：SEQ 1SEQ 6Group3：SEQ 1SEQ 7、Group4：SEQ 1SEQ 8、Group5：SEQ2 SEQ 5、Group6:SEQ2 SEQ6、Group7:SEQ2 SEQ7；Group8:SEQ2SEQ8；Group9：SEQ3 SEQ5、Group10:SEQ3 SEQ6、Group11:SEQ3 SEQ7；Group12:SEQ3 SEQ8；Group13:SEQ4 SEQ5、Group14:SEQ4 SEQ6、Group15:SEQ4 SEQ7、Group16:SEQ4 SEQ8。

10.根據權利要求9所述的一種HLA-B27等位基因分型檢測試劑盒，其特征在于，探針3’端的淬滅基團可以為：BHQ1、BHQ2、MGB、TAMRA、Eclipse-2、Dabcy1-2，所述的B27基因的探針組合Plan1:P1和P4、Plan2:P2和P4、Plan3:P3和P4；酶混合也包括熱啟動核酸聚合酶和UNG酶，熱啟動核酸聚合酶包括DNA聚合酶和熱啟動酶抗體，DNA聚合酶包含但不限于TaqDNA聚合酶、Super Taq DNA聚合酶、UlltraPE DNA聚合酶、LA Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、VentR DNA聚合酶、Phusion DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶中的一種或多種；陽性對照品和陰性對照品為HLA-B27細胞株DNA和非HLA-B27 DNA。