[發(fā)明專利]一種微囊藻毒素MC-LR的批量純化方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110600925.X
• 申請(qǐng)日: 2021-05-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113045632B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-08-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝林伸;劉瑛;黎雙飛;馮杰;劉芳;王煜;郝明途;蒙艷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳市環(huán)境科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C07K14/405
• 分類號(hào): C07K14/405;C07K1/16
• 代理公司: 深圳市智科友專利商標(biāo)事務(wù)所 44241
• 代理人: 曲家彬

一種微囊藻毒素MC?LR的批量純化方法，旨在克服現(xiàn)有技術(shù)中從自然水體中得到的微囊藻樣品復(fù)雜度高、雜質(zhì)干擾大，得到的藻毒素含量低，且樣品重復(fù)性差導(dǎo)致藻毒素制備工藝需不斷調(diào)整的缺點(diǎn)，該方法是從銅綠微囊藻中提取并純化得到微囊藻毒素MC?LR，包括以下步驟：一、銅綠微囊藻的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)；二、微囊藻毒素MC?LR的粗提取；三、采用MCI GEL CHP20P為填料的色譜柱去除粗提液中的雜質(zhì)，得到初步純化的微囊藻毒素；四、通過(guò)制備型HPLC對(duì)初步純化的微囊藻毒素進(jìn)一步純化，得到色譜純度大于95%的微囊藻毒素MC?LR。本發(fā)明得到的微囊藻毒素純度較高，且能夠?qū)崿F(xiàn)批量制備，為后續(xù)藻毒素的各項(xiàng)研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生化分離技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種微囊藻毒素MC-LR的批量純化方法。

背景技術(shù)

全球藍(lán)藻水華的不斷爆發(fā)，引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)污染水體中的藍(lán)藻毒素的高度關(guān)注，并對(duì)其毒性效應(yīng)進(jìn)行廣泛深入的研究，研究結(jié)果表明長(zhǎng)期接觸或飲用產(chǎn)毒藻水源的水生動(dòng)物或人類將導(dǎo)致一系列的毒性效應(yīng)。而微囊藻毒素的大多數(shù)研究都是基于自然污染水體采樣或采用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)室模擬實(shí)驗(yàn)，且采用的攻毒實(shí)驗(yàn)樣本也大都為濃縮藻粉或污染水體提取物，野外采樣雖可得到很大的生物量，但其樣品復(fù)雜度高、雜質(zhì)干擾大，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果受多種未知因素的影響，得到的藻毒素含量較低，樣品重復(fù)性差，使藻毒素制備純化工藝不能直接適用于不同批次樣品，每次需針對(duì)性進(jìn)行方案優(yōu)化，因此，需要用實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)的微囊藻來(lái)提取微囊藻毒素，并且需提出一種微囊藻毒素MC-LR的批量提純方法，能夠批量純化微囊藻毒素，且得到的微囊藻毒素純度較高，為后續(xù)開(kāi)展微囊藻毒素的各項(xiàng)研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中從自然水體中得到的微囊藻樣品復(fù)雜度高、雜質(zhì)干擾大，得到的藻毒素含量低，且樣品重復(fù)性差導(dǎo)致藻毒素制備工藝需不斷調(diào)整的缺點(diǎn)，提供了一種微囊藻毒素MC-LR的批量純化方法。

本發(fā)明實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的采用的技術(shù)方案是：一種微囊藻毒素MC-LR的批量純化方法，從銅綠微囊藻中提取并純化得到微囊藻毒素MC-LR，該純化方法包括以下步驟：步驟一、銅綠微囊藻的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)：采用BG11培養(yǎng)基進(jìn)行銅綠微囊藻的通氣培養(yǎng)，所述的銅綠微囊藻為Microcystis aeruginosa FACHB-905。

步驟二、微囊藻毒素MC-LR的粗提取：將步驟一中實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)得到的銅綠微囊藻進(jìn)行細(xì)胞破壁處理后，采用有機(jī)溶劑萃取得到微囊藻毒素MC-LR粗提液。

步驟三、微囊藻毒素MC-LR粗提液的除雜：采用MCI GEL CHP20P為填料的色譜柱進(jìn)行步驟二得到的粗提液的純化，去除粗提液中的雜質(zhì)，得到初步純化的微囊藻毒素MC-LR。

步驟四、微囊藻毒素MC-LR的制備型HPLC純化：通過(guò)初分離和二次制備對(duì)步驟三得到的初步純化的微囊藻毒素MC-LR進(jìn)行進(jìn)一步的純化，得到色譜純度大于95%的微囊藻毒素MC-LR。

初分離條件如下：流動(dòng)相A：H₂O+0.1% TFA，流動(dòng)相B：ACN+0.1% TFA；流速：8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm；進(jìn)樣量300 mL；檢測(cè)器：可見(jiàn)紫外分光檢測(cè)器；色譜分離梯度條件：0min，流動(dòng)相A 100%，35 min，流動(dòng)相A 90%，39 min，流動(dòng)相A 50%，43 min，流動(dòng)相A 0%，47min，流動(dòng)相A 100%。

二次制備條件如下：流動(dòng)相A：H₂O+0.1% TFA，流動(dòng)相B：ACN+0.1% TFA；流速：15mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm；進(jìn)樣量30 mL；檢測(cè)器：可見(jiàn)紫外分光檢測(cè)器；色譜分離梯度條件：0 min，流動(dòng)相A 90%，5 min，流動(dòng)相A 70%，13 min，流動(dòng)相A 65%，13.5 min，流動(dòng)相A65%，14 min，流動(dòng)相A 10%，15 min，流動(dòng)相A 10%，15.5 min，流動(dòng)相A 90%。