[發(fā)明專利]一種基于mNGS檢測COVID-19的方法及其應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2021-05-28
• 公開（公告）號: CN113337639B
• 公開（公告）日: 2022-01-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王棪;梁永;李玉龍;李立鋒;蔣智
• 申請（專利權(quán)）人: 天津金匙醫(yī)學(xué)科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C40B50/06
• 代理公司: 北京知匯林知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11794
• 代理人: 董濤

本發(fā)明提供一種基于mNGS的檢測COVID?19新型冠狀病毒的方法及其應(yīng)用，所述方法中通過設(shè)計(jì)制備COVID?19新型冠狀病毒的多重基因組特異性逆轉(zhuǎn)錄引物組，提高了新冠病毒RNA的逆轉(zhuǎn)錄效率，降低氣溶膠污染問題，同時(shí)還提高了對不同變異病毒核酸序列的富集能力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因檢測領(lǐng)域，具體涉及一種基于mNGS檢測COVID-19的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

新型冠狀病毒肺炎癥狀與普通肺炎相似，因此快速準(zhǔn)確的診斷技術(shù)對于患者救治有著至關(guān)重要的作用。目前，病情診斷和疫情篩查的主流檢測手段是實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測技術(shù)，該技術(shù)試驗(yàn)操作簡單，檢測時(shí)間短，靈敏度高，是目前快速診斷和大范圍人群篩查的首選。但該技術(shù)同樣存在著弊端，目前的商業(yè)化試劑盒通常以兩個(gè)新冠病毒特異性基因位點(diǎn)為靶點(diǎn)，僅能檢測兩個(gè)短序列，新冠病毒核酸是RNA，比DNA更容易降解，采樣后病毒死亡分裂，RNA完整性下降，檢測時(shí)如果剩余的核酸不在靶標(biāo)區(qū)域，就會出現(xiàn)假陽，而且新型狀病毒在不斷變異，一旦樣品中靶點(diǎn)區(qū)域出現(xiàn)突變，該檢測手段也會有漏檢的風(fēng)險(xiǎn)。

而基于二代測序的新冠病毒基因組檢測序列可覆蓋COVID-19序列全長。彌補(bǔ)了RT- PCR只可檢測少量COVID-19已知區(qū)域的缺點(diǎn)，不但可以提高檢測的準(zhǔn)確性，而且可以對病毒可能的變異進(jìn)行鑒別，根據(jù)基因型準(zhǔn)確判斷病情，制定治療方案，更可以據(jù)此追溯來源，摸清傳播途徑。因此，對新冠病毒的基因組檢測作為體外診斷方法已得到了國內(nèi)醫(yī)學(xué)界的普遍認(rèn)可，在國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案》中，新冠病毒的基因組檢測和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR一樣被定為疑似病例的確診依據(jù)。

常見的基因組測序手段有宏基因組和靶向富集檢測兩種，但目前宏基因組存在著對樣品內(nèi)全部核酸無差別檢測的弊端，高占比的人源核酸不僅降低了檢測靈敏度，還會因不同樣品的占比差異導(dǎo)致檢出信號強(qiáng)度不穩(wěn)定，產(chǎn)生假陰。而靶向富集多采用多重PCR 的手段富集新冠病毒基因組序列的方法去除人源核酸的干擾，但逆轉(zhuǎn)錄后針對cDNA的擴(kuò)增使用的循環(huán)數(shù)高，而且，PCR產(chǎn)物易造成交叉污染和氣溶膠污染，產(chǎn)生假陽性。而且只針對NCBI提供上的單一參考基因組序列設(shè)計(jì)引物，必然會把發(fā)生變異的基因序列排查在外。新冠病毒變異速度快，序列多樣性非常豐富，世界范圍內(nèi)不斷有新的病毒亞型被發(fā)現(xiàn)和上傳，截止目前為止，NCBI收錄的新冠病毒基因序列達(dá)到50,326條，只針對一個(gè)固定的基因組序列設(shè)計(jì)引物會降低對變異病毒序列的富集效果，造成假陰性。

有鑒于此，提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是尋求一種有效檢測新型冠狀病毒COVID-19的方法，為實(shí)現(xiàn)改目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

本發(fā)明首先提供一種病毒多重基因組特異性逆轉(zhuǎn)錄引物組制備方法，所述方法包括如下步驟：

步驟1)生成多重基因組：從基因組數(shù)據(jù)庫下載病毒的N1個(gè)基因組序列，將下載的所有基因組序列匹配對齊；所述100＜N1＜1000。

步驟2)制備候選引物組：將匹配好的多重基因組序列分割成有150-300nt(優(yōu)選197nt)重疊的300-500nt(優(yōu)選394nt)短片段，在每個(gè)片段兩端截取30-60nt(優(yōu)選 50nt)作為引物設(shè)計(jì)區(qū)域，針對該引物設(shè)計(jì)區(qū)域隨機(jī)設(shè)計(jì)多個(gè)10-15nt(優(yōu)選13nt) 的正向和/或反向引物，組成該區(qū)域待合并引物組；將每個(gè)區(qū)域待合并引物組的所有引物按出現(xiàn)頻率排序(優(yōu)選從高到低進(jìn)行排序)，選擇出現(xiàn)頻率最高且不含不確定堿基的引物，刪除與該引物序列相同的所有引物，對剩余的引物再次進(jìn)行排序篩選，重復(fù) N2次后，得到候選引物組；所述1≤N2≤8。

進(jìn)一步的，該方法還包括：

步驟3)引物篩選：對候選引物組經(jīng)二次篩選，刪除以下任意或多個(gè)情況的引物：Tm值與平均值偏離2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差以上、可能形成自身二聚體或交叉二聚體、存在5nt以上的均聚物重復(fù)堿基,經(jīng)篩選剔除得到最終多重基因組逆轉(zhuǎn)錄引物組。