[發明專利]一種可以穩定保存己糖激酶（HK）的緩沖體系

在審

• 申請號: 202110595464.1
• 申請日: 2021-05-29
• 公開（公告）號: CN113528499A
• 公開（公告）日: 2021-10-22
• 發明（設計）人: 李彩龍;孟琛;孫小芳
• 申請（專利權）人: 北京華宇億康生物工程技術有限公司
• 主分類號: C12N9/96
• 分類號: C12N9/96;C12N9/12
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種可以穩定保存己糖激酶的緩沖體系，通過在緩沖溶液中加入一定比例的牛血清白蛋白、葡聚糖、聚乙二醇、甘露醇、海藻糖等物質，配制一種既可以穩定保存己糖激酶，同時又可以直接用于體外診斷試劑生產的緩沖體系。解決了己糖激酶長期儲存的問題，也達到了在體外診斷試劑中直接應用的目的。

技術領域

本產品涉及酶制劑的儲存及體外診斷試劑技術領域，特別涉及利用己糖激酶作為反應底物的相關試劑盒。

背景技術

己糖激酶(Hexokinase)是生物體呼吸代謝過程中的關鍵酶之一，具有催化己糖磷酸化的作用。己糖激酶存在于所有細胞中，是細胞產生能量所需要的一種酶，共有5種亞型，其中I和II分布在線粒體外膜，與電壓依賴性陽離子通道蛋白結合；這種部位讓己糖激酶能直接獲得線粒體產生的ATP，ATP是己糖激酶的底物之一。研究證明，己糖激酶在固有免疫系統中發揮模式識別受體功能，類似免疫系統的守門人角色，具有重要的功能。這種機制不僅在動物細胞存在，在人體細胞內同樣存在。

己糖激酶可以用于多種試劑盒的配制，例如鎂離子，葡萄糖等測定試劑盒，利用己糖激酶法測定血糖含量是國際上推薦的葡萄糖測定方法。酶法檢測結果較為準確，可用于自動化分析儀，且酶法價格便宜，能夠滿足醫院檢驗和實驗室常規操作。酶法檢測是通過酶促反應進行的，通過底物引起一定波長下的吸光度變化，間接計算出待測物質含量。但是，同樣也存在一定問題，酶法由于其中有很多酶類參與生化反應，其穩定性是試劑成敗的關鍵。目前市場上流通的己糖激酶保存，均做不到在保證酶活的基礎上，延長儲存時間，因此配制的試劑極易受到溫度的影響和破壞。

因己糖激酶是酶制劑行業的小酶種，國內相關企業對其關注度不高。目前，國內對己糖激酶的研究主要集中在植物體代謝途徑和人體腫瘤上，用于診斷的己糖激酶的制備研究還未見報道。而且工業菌種發酵酶活力相對較低，使得己糖激酶生產成本偏高隨著生活水平的提高，需要做體外檢測的患者數量也在急劇上升，越來越多的患者需要血糖、鎂離子等試劑盒的檢測，但國內診斷用己糖激酶均源自進口，需要長時間保存，酶活性也有不同程度的降低，限制了己糖激酶相關檢測試劑在臨床及患者自用領域的推廣，因此一種可以穩定保存己糖激酶的體系，在保證酶活力的同時，也簡化了以己糖激酶沒底物的相關試劑盒的配制步驟，廉價的己糖激酶相關試劑盒會給相應的患者的檢測帶來便利。

發明內容

本發明提供了一種既可以長期穩定儲存己糖激酶，同時又可以直接用于一些以己糖激酶作為反應底物試劑盒生產的緩沖緩沖體系。此體系通過在原有緩沖體系基礎上添加酶保護物質，可以更好的解決相關試劑盒穩定性的問題，同時最大限度的保留了酶活力。

本發明是一種可以穩定保存己糖激酶(HK)的緩沖體系，其特征在于，包括儲存液和稀釋液；儲存液是由以下含量的成分組成：

所述稀釋液由以下含量的成分組成：

本發明所述的一種可以穩定保存己糖激酶(HK)的緩沖體系中，緩沖液為HEPES，主要起緩沖作用，使己糖激酶所處的體系PH維持相對穩定，減少環境變化對其穩定性的干擾。丙三醇、聚乙二醇、葡聚糖、甘露醇、海藻糖、蔗糖、BSA主要充當穩定劑的角色，保護己糖激酶活性穩定，同時在不同的體外診斷試劑中對試劑的穩定性提供保護。防腐劑為Proclin300，主要抑制試劑中細菌的滋生，從而保證己糖激酶活性的穩定。

為了測定本發明中酶的穩定性，采用以下方法：

酶活的測定：1、測定方法：分別添加1ml 0.05mol/L的TEA-HCL，1ml 0.555mol/L的D-葡萄糖溶液，0.1ml 0.019mol/L的ATP，0.2ml 0.1mol/L的MgCL2溶液，0.2ml 0.014mol/L的 NADP+，0.02ml 125U/ml的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶到試驗管和空白管。混勻后25℃水浴1min，與波長340nm處讀取吸光度A1。然后試驗管中加入0.05ml待測儲存液，空白管加入0.05ml DH2O，于25℃繼續反應5min，后速去吸光度A2。