[發明專利]一種采用二聯PCR檢測豬PPV、JEV的試劑及方法

在審

• 申請號: 202110594315.3
• 申請日: 2021-05-28
• 公開（公告）號: CN113186355A
• 公開（公告）日: 2021-07-30
• 發明（設計）人: 曹洪志;李成賢;李雪梅
• 申請（專利權）人: 宜賓職業技術學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 成都行之專利代理事務所(普通合伙) 51220
• 代理人: 史麗紅

1.一種采用二聯PCR檢測豬PPV、JEV的試劑，其特征在于，包含能擴增PPV的NS1基因和JEV的NS1基因的兩對特異性引物，其中P1和P2引物擴增PPV的NS1基因片段，擴增長度為750bp，P3和P4引物擴增JEV的NS1基因片段，擴增長度為475bp；

所述引物序列為如下核苷酸序列：

P1：SEQ ID NO：1；

P2：SEQ ID NO：2；

P3：SEQ ID NO：3；

P4：SEQ ID NO：4。

2.根據權利要求1所述的一種采用二聯PCR檢測豬PPV、JEV的試劑，其特征在于，包括10×PCR緩沖液2.5μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，25mmol/L Mg²⁺溶液3.5μL，40μmol/L P1、P2混合物0.7μL，40μmol/L P3、P4混合物0.3μL，JEV cDNA1μL、PPV DNA1μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，ddH₂O 11.6μL，其中JEV cDNA是JEV抽提后的RNA經過反轉錄后得到的cDNA。

3.一種采用二聯PCR檢測豬PPV、JEV試劑的制備方法，其特征在于，主要包括以下步驟：

(1)PPV的NS1基因和JEV的NS1基因序列的選擇：從GenBank數據庫中下載已經發表的PPV-VRI-1株的NS1、JEV-WHe株的NS1基因序列；

(2)根據選擇的PPV的NS1基因和JEV的NS1基因的靶序列，用PCR引物設計軟件分別進行引物的設計，將設計的引物進行最佳配對篩選試驗，得到2最佳引物：P1、P2及P3、P4，用全自動DNA合成儀進行引物的合成，其中P1和P2引物擴增PPV的NS1基因片段，擴增長度為750bp，P3和P4引物擴增JEV的NS1基因片段，擴增長度為475bp；

所述引物序列為如下核苷酸序列：

P1：SEQ ID NO：1；

P2：SEQ ID NO：2；

P3：SEQ ID NO：3；

P4：SEQ ID NO：4。

4.一種采用二聯PCR檢測豬PPV、JEV的方法，其特征在于，主要包括以下步驟：

(1)樣品的處理；

(2)病料樣品RNA/DNA的提取；

(3)二聯PCR反應：

采用25μL PCR反應體系；PCR反應體系的組成為：包括10×PCR緩沖液2.5μL，2.5mmol/LdNTP 4μL，25mmol/L Mg²⁺溶液3.5μL，40μmol/L P1、P2混合物0.7μL，40μmol/L P3、P4混合物0.3μL，JEV cDNA1μL、PPV DNA1μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，去ddH₂O 11.6μL；PCR反應條件為：95.5℃，預變性5min；95℃，變性30s；53.3℃，退火30s；72℃，延伸45s，共35個循環，最后72℃延伸5min，其中JEV cDNA是JEV抽提后的RNA經過反轉錄后得到的cDNA；

(4)結果判定

取二聯PCR產物在瓊脂糖凝膠上，電泳后在凝膠成像系統中觀察拍照，以標準DNAmarker(D,L-2000)作參考；電泳后，若瓊脂糖凝膠中同時出現2條核酸帶，且片段大小分別為750bp和475bp，說明病料樣品中同時含有PRV、JEV病毒；如果僅出現其中一個對應長度的核酸片段，則表明病料樣品中只含有其中一種病毒；若不出現任何核酸片段，則表明病料樣品中不含有PRV、JEV病毒。

5.根據權利要求4所述的一種采用二聯PCR檢測豬PPV、JEV的方法，其特征在于，步驟(4)中，取5μl產物在1.5％的瓊脂糖凝膠上電泳30min后在凝膠成像系統中進行觀察。

6.根據權利要求4所述的一種采用二聯PCR檢測豬PPV、JEV的方法，其特征在于，步驟(3)中，JEV的cDNA的合成反應體系：5×PrimeScript^TM緩沖液2μL，PrimeScript^TMRT-EnzymeMix I 0.5μL，40μmol/L Specific down primer 0.25μL，總RNA 2μL，RNase Free ddH₂O5.52μL。