[發明專利]一種重組噬菌體的構建方法

有效

• 申請號: 202110591986.4
• 申請日: 2021-05-28
• 公開（公告）號: CN113136372B
• 公開（公告）日: 2023-08-01
• 發明（設計）人: 鄭德洪;彭仕文;袁高慶
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/63
• 代理公司: 北京眾達德權知識產權代理有限公司 11570
• 代理人: 張曉冬

1.一種青枯雷爾氏菌（Ralstonia?solanacearum）重組噬菌體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟

（1）提取絲狀噬菌體復制型DNA；

（2）制備帶有目的基因的Tn5轉座子DNA；

（3）體外插入轉座子DNA：取等摩爾量的絲狀噬菌體復制型DNA和轉座子DNA，在Tn5轉座酶的作用下，37℃孵育2h；

（4）轉化大腸桿菌DH5α?λpir：采用熱激法，利用步驟（3）獲得的反應物轉化經氯化鈣處理制備的大腸桿菌DH5α?λpir感受態細胞；

（5）制備混合質粒文庫：收集步驟（4）的大腸桿菌轉化子，加入液體培養基，混勻，利用SDS堿裂法提取混合菌液中的質粒；

（6）轉化宿主細胞：采用電激法，利用步驟（5）提取的混合質粒文庫轉化絲狀噬菌體的宿主細菌，經篩選，獲得轉化子；

（7）篩選重組噬菌體：隨機挑取多個經步驟（6）的轉化子，接種于液體培養基中，震蕩培養，離心，濾過上清液；將濾液與絲狀噬菌體的指示細菌混合培養，于不同時間點檢測指示細菌的抗性來判斷重組噬菌體的活性；

（8）檢測目的基因的表達：將具有活性的重組噬菌體感染宿主細菌，提取感染后細菌的總蛋白，使用外源目的基因所編碼蛋白的抗體，通過蛋白免疫印跡檢測目的基因的表達情況；

其中，步驟（1）中絲狀噬菌體為青枯雷爾氏菌（Ralstonia?solanacearum）的絲狀噬菌體RSCq，其復制型雙鏈環狀DNA共計7480bp，序列見SEQ?ID?No.1；

步驟（2）中Tn5轉座子DNA兩側為Tn5轉座酶的識別序列，且內部包含絲狀噬菌體復制型DNA在大腸桿菌中復制所需的復制起始位點ori、用于篩選卡那霉素抗性的Kan^R基因、以及帶啟動子和翻譯元件的目的基因；

步驟（2）中目的基因為通過商業化基因合成服務合成的由lac啟動子控制的降解青枯雷爾氏菌群體感應信號分子的酯酶elp104?DNA，序列見SEQ?ID?No.2；

步驟（3）的反應體系為：RSCq復制型DNA?5?μL、轉座子DNA?3?μL、EZ-Tn5?10X?反應緩沖液?1?μL、EZ-Tn5?轉座酶?1?μL，總計10μL。