[發(fā)明專利]一種GS基因敲除CHO-K1細胞株的構建方法及懸浮細胞單克隆化

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• 申請日: 2021-05-28
• 公開（公告）號: CN113355360A
• 公開（公告）日: 2021-09-07
• 發(fā)明（設計）人: 焦鵬;徐琦;陳少勇;林文龍;李睿;黃啟龍
• 申請（專利權）人: 上海碧博生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/87
• 分類號: C12N15/87;C12N15/55;C12N15/52;C12N5/10
• 代理公司: 上海浦一知識產(chǎn)權代理有限公司 31211
• 代理人: 戴廣志

1.一種GS基因敲除的CHO-K1細胞株的構建方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

步驟A：基于CHO-K1細胞GS外顯子-5的核苷酸序列，設計并選擇sgRNA-GS57用于對GS基因的敲除；

外顯子-5的核苷酸序列如SQE ID NO.1所示；

sgRNA-GS57的核苷酸序列如SQE ID NO.2所示；

步驟B：將sgRNA-GS57與EGFP mRNA、Cas9 mRNA組成轉染混合物，對CHO-K1細胞進行共轉染，使用FACS分選出共轉染的CHO-K1細胞，再將共轉染的CHO-K1細胞進行單細胞分選，接種單個共轉染的CHO-K1細胞，靜置培養(yǎng)，得到單克隆的GS基因敲除CHO-K1細胞株。

2.如權利要求1所述的GS基因敲除的CHO-K1細胞株的構建方法，其特征在于，所述方法還包括如下步驟：

步驟C：檢驗步驟F得到的GS基因敲除的CHO-K1單克隆細胞株的GS表達；

步驟D：對步驟F得到的GS基因敲除的CHO-K1單克隆細胞株進行二代測序，檢驗GS基因敲除效果。

3.如權利要求1所述的GS基因敲除的CHO-K1細胞株的構建方法，其特征在于，步驟B中，所述轉染混合物的EGFP mRNA與Cas9 mRMA的摩爾量比滿足如下關系：EGFP mRNA∶Cas9mRMA＝1∶10。

4.如權利要求3所述的GS基因敲除的CHO-K1細胞株的構建方法，其特征在于，所述轉染混合物使用的培養(yǎng)基為減血清培養(yǎng)基，所述轉讓混合物還包括轉染試劑。

5.如權利要求1所述的GS基因敲除的CHO-K1細胞株的構建方法，其特征在于，步驟B中，待轉染的CHO-K1細胞經(jīng)貼壁培養(yǎng)得到，所使用的培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的F12K培養(yǎng)基。

6.如權利要求1所述的GS基因敲除的CHO-K1細胞株的構建方法，其特征在于，步驟B中，轉染時間為三天，其中，使用含10％胎牛血清的F12K培養(yǎng)基培養(yǎng)一天，之后更換培養(yǎng)基培養(yǎng)兩天，更換后的培養(yǎng)基為含10％胎牛血清和4mM L-谷氨酰胺的F12K培養(yǎng)基。

7.如權利要求1所述的GS基因敲除的CHO-K1細胞株的構建方法，其特征在于，步驟B中，F(xiàn)ACS分選出的共轉染CHO-K1細胞為GFP陽性的共轉染CHO-K1細胞。

8.如權利要求7所述的GS基因敲除的CHO-K1細胞株的構建方法，其特征在于，將GFP陽性的共轉染CHO-K1細胞進行單細胞分選后，培養(yǎng)單克隆細胞株的具體步驟如下：

步驟B1：對GFP陽性的共轉染CHO-K1細胞進行單細胞分選后，接種至96孔板，并對96孔板進行細胞成像，選出由單細胞長成的克隆細胞，并進行培養(yǎng)；

步驟B2：當由單細胞長成的克隆細胞長至40％-50％匯合度時，擴培至24孔板，再長至70％-80％匯合度時，即可進行細胞凍存。

9.如權利要求8所述的GS基因敲除的CHO-K1細胞株的構建方法，其特征在于，

步驟B1中，96孔板所使用的培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的F12K培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基中還包括1％含量的青鏈霉素溶液；

步驟B2中，24孔板所使用的培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的F12K培養(yǎng)基。

10.如權利要求2所述的GS基因敲除的CHO-K1細胞株的構建方法，其特征在于，檢驗GS基因敲除的CHO-K1單克隆細胞株的GS表達的步驟如下：

步驟C1：使用細胞裂解液對GS基因敲除的CHO-K1單克隆細胞株進行細胞裂解，再將細胞裂解物進行凍融處理，之后將凍融處理的細胞裂解物與上樣緩沖液混合并煮沸處理后待用；

步驟C2：采用蛋白質印跡法對步驟F1得到的產(chǎn)物進行GS表達分析。