[發(fā)明專利]牛筋草EPSPS蛋白ELISA檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110587647.9
• 申請(qǐng)日: 2021-05-27
• 公開（公告）號(hào): CN114280306B
• 公開（公告）日: 2023-05-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳景超;李香菊;崔海蘭;于惠林
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
• 主分類號(hào): C07K14/415
• 分類號(hào): C07K14/415
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 黃爽

本發(fā)明提供一種牛筋草EPSPS蛋白ELISA檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。通過(guò)原核表達(dá)獲得重組EPSPS蛋白，將重組蛋白免疫小鼠，篩選得到特異性的單克隆抗體，開發(fā)出定量檢測(cè)EPSPS蛋白含量的酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)試劑盒。并建立了雙抗體夾心ELISA法，通過(guò)優(yōu)化得到ELISA試劑盒體系，可定量檢測(cè)EPSPS蛋白。本發(fā)明采用ELISA檢測(cè)技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)植物中的EPSPS蛋白進(jìn)行定性定量檢測(cè)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)單快速等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種牛筋草EPSPS蛋白ELISA檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

草甘磷是一種非選擇性的廣譜除草劑，具有高效、低毒、無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)，尤其是對(duì)人畜毒害小，是全球應(yīng)用最廣的除草劑之一。草甘膦的靶標(biāo)是5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate?synthase，EPSPS)，EPSPS是生物體內(nèi)芳香族氨基酸—色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶；草甘磷是通過(guò)抑制EPSPS的活性而阻斷芳香族氨基酸的合成最終導(dǎo)致受試植物死亡。但是作為一種非選擇性除草劑，草甘膦對(duì)農(nóng)作物同樣具有滅生性作用，這限制了草甘膦在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。美國(guó)孟山都公司通過(guò)向植物中轉(zhuǎn)入具草甘膦抗性的CP4-EPSPS等基因，成功培育出了商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因抗草甘膦作物，為草甘膦的應(yīng)用開辟了新途徑。目前已經(jīng)獲得了大豆、玉米、棉花、油菜、煙草、甜菜、花生、小麥、水稻或向日葵等抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物。

草甘膦的長(zhǎng)期使用，引起雜草對(duì)草甘膦產(chǎn)生抗性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因作物減產(chǎn)。雜草對(duì)草甘膦的靶標(biāo)抗性機(jī)制分為靶標(biāo)突變和靶標(biāo)酶過(guò)量表達(dá)兩種。目前，抗性的分子檢測(cè)方法主要有：(1)EPSPS序列保守位點(diǎn)PCR檢測(cè)；(2)EPSPS基因表達(dá)量qPCR檢測(cè)；(3)EPSPS蛋白免疫印跡檢測(cè)等，其中PCR與qPCR的方法對(duì)場(chǎng)地、儀器、技術(shù)人員的要求比較高，樣本處理復(fù)雜，成本較高。蛋白免疫印跡檢測(cè)方利用免疫學(xué)原理對(duì)目的蛋白進(jìn)行定性定量鑒定，利用靶標(biāo)蛋白抗體可以通過(guò)Western?blot和ELISA方法進(jìn)行定性定量分析，檢測(cè)植株中目的蛋白在不同組織器官和不同環(huán)境條件下的表達(dá)水平。利用該方法可以快速、批量檢測(cè)不同牛筋草植株靶標(biāo)蛋白EPSPS的含量，快速鑒定抗性牛筋草植株。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供牛筋草EPSPS蛋白ELISA檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，第一方面，本發(fā)明提供一種牛筋草EPSPS蛋白，所述蛋白包含如下的氨基酸序列或由其組成：

i)如SEQ?ID?NO:1所示的氨基酸序列；或

ii)在i)的N端和/或C端連接標(biāo)簽得到的氨基酸序列；或

iii)i)或ii)的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。

第二方面，本發(fā)明提供編碼所述牛筋草EPSPS蛋白的核酸分子。

經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化后的核酸分子的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。

第三方面，本發(fā)明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重組DNA、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒載體、病毒載體、工程菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。

第四方面，本發(fā)明提供一種抗牛筋草EPSPS蛋白單克隆抗體，由保藏編號(hào)為CGMCCNo.22308的雜交瘤細(xì)胞株FL-374-08分泌產(chǎn)生。該雜交瘤細(xì)胞株現(xiàn)已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏日期2021年4月14日。