[發明專利]一種提高谷氨酸棒狀桿菌重組菌L-賴氨酸產量的方法

在審

• 申請號: 202110585322.7
• 申請日: 2021-05-27
• 公開（公告）號: CN113308425A
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發明（設計）人: 汪俊卿;王子睿;王瑞明;李丕武;陸捷;楊翠平;王松江;郭傳莊;隋松森;王建彬;李俊霖
• 申請（專利權）人: 齊魯工業大學;諸城東曉生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/77;C12N15/64;C12P13/08;C12R1/15
• 代理公司: 濟南竹森知識產權代理事務所(普通合伙) 37270
• 代理人: 朱家富

1.一種改造HTR基因5′端序列的谷氨酸棒狀桿菌重組菌，其特征在于，是在谷氨酸棒狀桿菌宿主菌中，將HTR基因5′端序列中起始密碼子ATG前-58位～-49位核苷酸序列^-58ACGTCTAGAC^-49替換為^-58TGTGGTATAA^-49，降低HTR基因5′端序列二級結構的穩定性，使其更易于被轉錄或表達。

2.如權利要求1所述的谷氨酸棒狀桿菌重組菌，其特征在于，所述谷氨酸棒狀桿菌宿主菌為谷氨酸棒狀桿菌CICC23604或谷氨酸棒狀桿菌CGMCC1.15647。

3.如權利要求1所述的谷氨酸棒狀桿菌重組菌，其特征在于，所述HTR的氨基酸序列為SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.8。

4.如權利要求1所述的谷氨酸棒狀桿菌重組菌，其特征在于，所述HTR基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.9；

優選的，所述HTR基因的核苷酸序列為與SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.9的序列一致性大于等于99.3％的核苷酸序列。

5.如權利要求1所述的谷氨酸棒狀桿菌重組菌，其特征在于，所述HTR基因5′端序列為SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.10；

優選的，所述HTR基因5′端序列為與SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.10的序列一致性大于等于98.0％的核苷酸序列。

6.權利要求1所述的谷氨酸棒狀桿菌重組菌的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)合成上游同源臂-^-58TGTGGTATAA^-49-下游同源臂的核苷酸序列，其中上游同源臂和下游同源臂為HTR基因5′端序列中起始密碼子ATG前-58位～-49位核苷酸序列^-58ACGTCTAGAC^-49的前后各一段長度500～600bp的核苷酸序列；

(2)將上游同源臂-^-58TGTGGTATAA^-49-下游同源臂的核苷酸序列連接至pK19mobsacB載體中，構建替換載體；

(3)將替換載體轉化谷氨酸棒狀桿菌宿主菌感受態細胞，篩選具有卡那霉素抗性的陽性轉化子，獲得發生了第一次同源單交換的重組菌；

(4)將發生了第一次同源單交換的重組菌自然傳代后，篩選能在10％蔗糖培養基生長但不能在具有卡那霉素抗性的培養基生長的菌落，驗證后得到完成兩次同源單交換的谷氨酸棒狀桿菌重組菌。

7.如權利要求6所述的構建方法，其特征在于，滿足以下條件之一項或多項：

i.步驟(2)中將上游同源臂-^-58TGTGGTATAA^-49-下游同源臂的核苷酸序列連接至pK19mobsacB載體的Hind III、EcoR I酶切位點之間；

ii.步驟(3)中以卡那霉素抗性基因引物采用PCR擴增技術篩選具有卡那霉素抗性的陽性轉化子，所述引物序列如下：

F1：5′-ATGATTGAACAAGATGGATTGC-3′，

R1：5′-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG-3′；

所述PCR擴增的體系為：2×HiFi-PCRmaster10μL，10μmol/L上游引物1μL，10μmol/L下游引物1μL，模板1μL，ddH₂O 7μL；

所述PCR擴增的程序為：95℃預變性5min；94℃變性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，30個循環；72℃延伸10min，4℃保存；

iii.步驟(4)中所用培養基為LBG培養基：葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L。

8.權利要求1所述的谷氨酸棒狀桿菌重組菌在生產L-賴氨酸中的應用。