[發(fā)明專利]一種用于卵巢癌早期診斷及預后評估的檢測試劑盒

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• 申請日: 2021-05-27
• 公開（公告）號: CN113325178A
• 公開（公告）日: 2021-08-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王平;朱必清;武雅琴;沈揚;吳東辰;徐衛(wèi)國;李志鵬
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇省腫瘤醫(yī)院
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;G01N33/68
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標事務所(普通合伙) 32249
• 代理人: 梁天彥

1.一種卵巢癌生物標記物緊密連接蛋白3(CLDN3)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒具體包括：CLDN3標準品A-F、多克隆抗體包被板、辣根過氧化物酶(HRP)標記多克隆抗體、陽性對照質(zhì)控品、陰性對照質(zhì)控品和輔助試劑。

2.如權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，還包括：ELISA酶標板、凍干標準品A-F、陽性對照、陰性對照、HRP標記的CLDN3多克隆抗體、25x濃縮洗滌液、底物反應液、反應終止液和封板膜。

3.如權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒中的凍干標準品，其特征在于，其中A-F提取自人血漿，標準品A、B、C、D、E、F中抗CLDN3抗體濃度分別為調(diào)至100±10ng/ml，50±10ng/ml，25±2.5ng/ml，12.5±1.2ng/ml，6.25±0.6ng/ml，3.125±0.3ng/ml，將所獲得的6份血清按每個試劑盒的需要量分裝，冷凍干燥，即制備成梯度濃度CLDN3標準品。

4.如權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述的多克隆抗體包被板可用CLDN3純品對Balb/c小鼠免疫獲得的多克隆抗體包被酶標板制作而成，具體步驟如下：

(1)制備多克隆抗體：用CLDN3純品采取腹腔注射和皮下注射免疫Balb/c小鼠，再在腹腔內(nèi)注射小鼠骨髓瘤細胞SP2/0；收集腹水經(jīng)重組Protein G預裝層析柱純化后即獲得CLDN3多克隆抗體；

(2)包被：使用新鮮配制的0.02-0.08mol/LNa₂CO₃-NaHCO₃(pH8-10)溶液將CLDN3多克隆抗體稀釋至2-10mg/L，0-8℃過夜，用Tween-20的PBS洗滌；加入100-500μl含有5-20g/L BSA的PBST，37℃封閉1-3h，用PBST洗滌后甩干晾曬，即獲得多克隆抗體包被酶標板。

5.如權(quán)利要求4所述的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，

所述地Na₂CO₃-NaHCO₃的濃度為0.05mol/L；

所述地Na₂CO₃-NaHCO₃ pH為9.6；

所述地CLDN3多克隆抗體稀釋至5mg/L；

所述地過夜溫度為4℃。

6.如權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其中辣根過氧化物酶(HRP)標記多克隆抗體是用辣根過氧化物酶(HRP)標記CLDN3多克隆抗體制備而成，

其特征在于，具體步驟如下：

(1)取HRP 2-8mg溶于0.1-0.5M碳酸氫鈉溶液中，電磁攪拌；

(2)加0.5-2％2.4二硝基氟苯無水乙醇溶液0.05-0.3ml，室溫避光攪拌；

(3)加0.01-0.1M過碘酸鈉0.5-2ml，室溫避光攪拌10-50min；

(4)加0.1-0.2M乙二醇0.1-2ml，室溫避光攪拌30-90min；在0.005-0.02M(pH9.5)碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液4℃透析10-40h，中間換液3-8次；

(5)加入純化CLDN3多克隆抗體2-10mg的0.05-0.2M(pH9.5)碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液0.5-2ml，室溫避光攪拌100-200min；

(6)加入2-10mg硼氫化鈉，置4℃靜置100-300min；

(7)0.02M(pH7.4)PBS，4℃透析12-36h，換液1-5次，即獲得HRP酶標多克隆抗體。

7.如權(quán)利要求6所述的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，

所述地HRP為5mg；

所述地碳酸氫鈉溶液為1ml 0.3M；

所述地，加1％2.4二硝基氟苯無水乙醇溶液0.1ml；

所述地過碘酸鈉為0.06M 1ml；

所述地乙二醇為0.16M 1ml；

所述地碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液為0.01M(pH9.5)。