[發(fā)明專利]一種檢測活細(xì)胞細(xì)胞膜與骨架間應(yīng)力傳遞的生物探針

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110583124.7
• 申請日: 2021-05-27
• 公開（公告）號: CN113321741B
• 公開（公告）日: 2023-01-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉波;韓金鑫;張航與;李娜;張鄭瑤
• 申請（專利權(quán)）人: 大連理工大學(xué)
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;G01N21/64
• 代理公司: 大連理工大學(xué)專利中心 21200
• 代理人: 梅洪玉

本發(fā)明公開了一種檢測活細(xì)胞細(xì)胞膜與骨架間應(yīng)力傳遞的生物探針，其包括FRET熒光蛋白對、蛛絲蛋白Spider fibroin、JTK8蛋白的SH1結(jié)構(gòu)域以及β?actin五個(gè)部分。探針進(jìn)入活細(xì)胞并表達(dá)，通過應(yīng)力檢測單元間的FRET效率變化定量檢測活細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞膜與骨架間應(yīng)力的變化。該生物探針實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞膜與骨架間應(yīng)力傳遞的可視化檢測，具有可動(dòng)態(tài)檢測、靈敏度高、時(shí)間分辨率高、成本低等特點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測活細(xì)胞細(xì)胞膜與骨架間應(yīng)力傳遞的生物探針。

背景技術(shù)

細(xì)胞膜與骨架間的應(yīng)力傳遞可能是應(yīng)力傳遞機(jī)制的第一步，應(yīng)力信號通過細(xì)胞骨架傳遞到細(xì)胞內(nèi)部，激活細(xì)胞內(nèi)遷移和粘附相關(guān)機(jī)制。應(yīng)力信號可能通過這一途徑，調(diào)控疾病病理過程。細(xì)胞膜與骨架間的應(yīng)力傳遞是應(yīng)力傳遞機(jī)制的重要環(huán)節(jié)，但目前仍缺乏相關(guān)研究工具。鑒于此，本發(fā)明提出一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonanceenergy transfer，F(xiàn)RET)技術(shù)，可檢測活細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞膜與骨架間應(yīng)力傳遞的生物探針。該探針具有動(dòng)態(tài)檢測、靈敏度高、時(shí)間分辨率高等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種可活細(xì)胞內(nèi)檢測細(xì)胞膜與骨架間應(yīng)力傳遞的新型生物探針，基于FRET技術(shù)，運(yùn)用亞克隆技術(shù)制備檢測活細(xì)胞細(xì)胞膜與骨架間應(yīng)力傳遞的生物探針。探針在活細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并定位于目的位置，通過能量轉(zhuǎn)移效率變化定量檢測細(xì)胞膜與骨架間應(yīng)力的大小。

細(xì)胞膜與骨架間應(yīng)力傳遞可視化探針包括FRET熒光蛋白對、蛛絲蛋白(Spiderfibroin)、重組人酪氨酸蛋白激酶(recombinant human tyrosine-proteinkinase,JTK8)的SH 1結(jié)構(gòu)域以及β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)五個(gè)部分，運(yùn)用亞克隆技術(shù)對這五個(gè)部分的DNA序列進(jìn)行酶切與連接，將得到的新DNA序列與pcDNA3.1(+)重組構(gòu)成目的質(zhì)粒。JTK8蛋白的SH1結(jié)構(gòu)域能將其錨定于脂筏微區(qū)，是脂筏與JTK8蛋白的連接點(diǎn)。此外，選取該結(jié)構(gòu)域還排除了JTK8蛋白功能變化對探針工作的干擾。選擇β-actin作為羧基端的目的是確保探針能夠與細(xì)胞骨架系統(tǒng)結(jié)合并精準(zhǔn)錨定于微絲。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

一種檢測活細(xì)胞細(xì)胞膜與骨架間應(yīng)力傳遞的生物探針，其包括應(yīng)力檢測單元以及位于應(yīng)力檢測單元兩端的JTK8蛋白的SH1結(jié)構(gòu)域和β-actin蛋白；所述的應(yīng)力檢測單元包括由蛛絲蛋白連接的熒光蛋白對；其中，

所述的蛛絲蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；

JTK8蛋白的SH1結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

β-actin蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

進(jìn)一步地，所述的熒光蛋白對選自藍(lán)色熒光蛋白(blue fluorescent protein,BFP)和綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)，GFP及其變體(EGFP,mClover3,mNeonGreen,mCerulean和mVenus)和紅色熒光蛋白(red fluorescent protein,RFP)及其變體(mCherry,mRuby3,mRuby2和mRuby)，青色熒光蛋白(cyan fluorescent protein,CFP)及其變體(mTurquoise2,mCerulean3,mTFP1,Aquamarine和ECFP)和黃色熒光蛋白(yellowfluorescent protein,YFP)及其變體(EYFP,mVenus,mCitrine,sEYFP和YPet)。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的熒光蛋白對為增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhancedcyan fluorescent protein,ECFP)和能量轉(zhuǎn)移黃色熒光蛋白(yellow fluorescentprotein for energy transfer,Ypet)。