[發明專利]一種紅曲霉單加氧酶突變體及其應用

有效

• 申請號: 202110583105.4
• 申請日: 2021-05-27
• 公開（公告）號: CN113308443B
• 公開（公告）日: 2022-03-25
• 發明（設計）人: 李牧;劉佳瑋;段雅麗;易志強
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P17/06;C12R1/19
• 代理公司: 成都坤倫厚樸專利代理事務所(普通合伙) 51247
• 代理人: 吳亦雨

本發明屬于單加氧酶領域，具體涉及一種紅曲霉單加氧酶突變體及其應用。具體技術方案為：一種單加氧酶突變體，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。與野生型單加氧酶相比，本發明提供的單加氧酶突變體可更高效率地催化生成產物嗜氮酮。反應產物嗜氮酮的合成效率由44.2％提高到92.8％，分離純化后嗜氮酮含量高于99％。本發明提供的單加氧酶催化產生的嗜氮酮產量更高、純度更高、分離更簡單。

技術領域

本發明屬于單加氧酶領域，具體涉及一種紅曲霉單加氧酶突變體及其應用。

背景技術

嗜氮酮是一類具有吡喃醌雙環結構的化合物，主要由微生物或植物產生。嗜氮酮的分子結構中，氧原子容易被有機氮化合物中的氮原子取代，因此得名嗜氮酮。這類化合物被發現具有抗癌、抗菌、消炎、減肥、降血壓和降血脂等多種醫療功能。

目前最常用的制備嗜氮酮類化合物的方法是從植物中提取。但該方法受植物種植面積、植物品種以及氣候變化等因素影響，導致嗜氮酮的產量和質量并不穩定。而如果利用微生物生產嗜氮酮，則能夠克服上述缺點；且微生物發酵的生產成本更低。

微生物合成嗜氮酮的過程中，最關鍵的步驟是單加氧酶催化分子內的羰基與醛基縮合，得到嗜氮酮化合物。紅曲霉能夠產生大量嗜氮酮(紅曲色素，Azanigerone E)，其分子結構式如下所示：

因此，紅曲霉中能夠催化合成嗜氮酮的單加氧酶(monooxygenase)，具有較高的潛在應用價值。但該酶的催化活性較低，阻礙了相關應用。

發明內容

本發明的目的是提供一種紅曲霉單加氧酶突變體及其應用。

為實現上述發明目的，本發明所采用的技術方案是：一種單加氧酶突變體，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

相應的，一種單加氧酶突變體，將野生型單加氧酶第176位的精氨酸突變為丙氨酸，野生型單加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

相應的，所述單加氧酶突變體的制備方法，包括如下步驟：

(1)從紅曲霉中提取、獲得野生型單加氧酶編碼DNA片段，如SEQ ID NO.3所示；

(2)使用基因技術，對野生型單加氧酶編碼DNA片段進行點突變，獲得帶有單加氧酶突變體基因的重組質粒；

(3)將重組質粒轉化到微生物中，培養微生物，獲得所述單加氧酶突變體。

優選的，步驟(2)制備重組質粒的方法為：設計并合成帶有點突變的引物，引物序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示，以質粒pET30a(+)-WT為模板，通過PCR技術實現質粒滾環復制，利用引物獲得帶有單加氧酶突變體基因的重組質粒。

優選的，步驟(3)所述微生物為大腸桿菌。

相應的，所述單加氧酶突變體在催化制備嗜氮酮中的應用。

優選的，將2-醛基-苯乙酮溶于PBS緩沖液，加入單加氧酶突變體和NADPNa進行反應，即得產物嗜氮酮。

優選的，反應完成后，加入乙酸乙酯萃取提純產物。

本發明具有以下有益效果：與野生型單加氧酶相比，本發明提供的單加氧酶突變體可更高效率地催化生成嗜氮酮。反應產物中，嗜氮酮的生成效率由44.2％提高到92.8％，分離純化后嗜氮酮含量高于99％。本發明提供的單加氧酶所產生的嗜氮酮產量更高、純度更高、分離更簡單。

具體實施方式