[發明專利]用于檢測LSDV的引物和試劑盒

在審

• 申請號: 202110583002.8
• 申請日: 2021-05-27
• 公開（公告）號: CN113373263A
• 公開（公告）日: 2021-09-10
• 發明（設計）人: 李守軍;王京煜;賈坤
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣州正明知識產權代理事務所(普通合伙) 44572
• 代理人: 張麗

本發明屬于檢測技術領域，公開了用于檢測LSDV的引物和試劑盒，本發明通過檢測LSDV RPO30基因，借助ERA技術，結合熒光探針的特性，構建出能夠檢測LSDV的ERA方法，其最低檢測限為1×10²拷貝/μL。綜上所述，本研究建立的LSDV RPO30的檢測方法，42℃恒溫條件15分鐘即可實現對目的片段的有效擴增，具有操作簡單、敏感性高、特異性強和快速等優點，適用于現場和基層檢測。

技術領域

本發明涉及檢測技術領域，更具體地，涉及用于檢測LSDV的引物和試劑盒。

背景技術

牛結節性皮膚病(Lumpy skin disease，LSD)，也被稱為牛疙瘩皮膚病、牛結節疹或牛結節性皮炎，是一種重要的以牛為主要自然宿主和傳染源的痘病毒疾病，是由痘病毒科(Poxviridae)脊椎動物痘病毒亞科(Chordopoxvirinae，ChPV)山羊痘病毒屬(Capripoxvirus，CaPV)牛結節性皮膚病病毒(Lumpy skin disease virus，LSDV)引起的。通常情況下，LSDV在常溫下可以長時間存活，尤其在干燥的結痂中可以存活35天，非常穩定。此外，LSDV在風干的獸皮中至少存活18天，在壞死的皮膚結節中能存活長達33天甚至更久。該病毒還對紫外線和含有脂質溶劑的洗滌劑較敏感。

對于牛結節性皮膚病目前并沒有好的免疫方法和治療措施，只能通過快速檢測來控制疫情的發展，目前對于LSDV的診斷方法主要包括臨床檢查、常規聚合酶鏈式反應(PCR)，實時熒光定量PCR，高分辨率熔解(high-resolution melting，HRM)曲線分析法，環介導等溫擴增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)和重組酶聚合酶擴增法(recombinase polymerase amplification，RPA)。免疫學方法能定性、定量檢測血清抗體或感染性抗原，是LSD實驗室診斷的重要依據，可取牛結節或活檢樣品研磨液、破潰結節內漿液、眼鼻分泌物、血清等進行檢測。OIE推薦應用病毒中和試驗(virus neutralizationtest，VNT)檢測LSDV特異性血清抗體。該方法也適用于LSD群流行病學調查和疫苗免疫保護效果評價等。此外，已有商品化酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒用于羊痘病毒屬的檢測，但不能進行屬內不同種病毒的區分。

上述檢測方法要么需要專業的技術人員操作，要么檢測時間和程序較為復雜，不適合現場快速檢測。

發明內容

本發明為了克服現有技術中缺乏LSDV的現場快速檢測方法，首先提供用于適用于現場快速檢測的LSDV的引物和探針。

本發明的第二個目的是提供含有上述引物和探針的試劑盒。

本發明的目的通過以下技術方案實現：

用于檢測LSDV的ERA引物和探針，所述引物為RPO30-ERA-F1、RPO30-ERA-R1，序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述探針為RPO30-ERA-probe，序列如SEQ ID NO：3所示。

本發明還提供用于檢測LSDV的ERA試劑盒，包含所述的引物和探針。

優選的，所述的試劑盒還包括激活劑和溶解劑；均來自基礎型核酸擴增試劑盒。

優選的，所述試劑盒的反應體系：探針0.72μL、引物RPO30-ERA-F1 2.1μL、引物RPO30-ERA-R1 2.1μL、模板2μL、激活劑2μL、溶解劑20μL、ddH₂O 21.08μL。

優選的，所述試劑盒的反應溫度為42℃。